卡氏肺孢子虫特异性DNA探针制备及其实验应用.pdf

南京鞋辩大学硕±举位论文 卡氏肺孢子虫特异性DNA探针的制备及其实验应用 硕士研究生 徐霞 导 绛 陈锡慰 南京医科大学病原生物学系 210029 巾文摘要 ＼稼酸分子杂交诈为分子是耪学的基本技术已狡广泛瘸于嚣学基 础和临床研究。因其具有灵敏度高、特异性好和相对简易的优点，已 被用于多种病原体的检测。十 本磺究采用醋酸泼尼扮龙诱导建立卡氏踌匏子虫蹿炎 carinii (Pneumocystis 基本材糟。以随勰；；耪法到备地高辛据{己翡i≥放麓牲探舒，采麓斑点 杂交检测大鼠模型肺组织和患者临床标本中的卡氏肺孢子虫 caring，Pc)DNA。 (Pneumocystis l。PCP火鼠模裂的建立、乳检测及实验标本的采集， 采用SD太鼠，醋酸泼尼松龙腹股沟皮下注射2个月，诱导建立 PCP动物模型。f免莲操作取交死亡天蔑鳇髂经织，切蠡锨每片，分爱 进行吉氏染色和快速银染，照微镜下查找心。从每只火鼠的肺组织 中分离黝包囊和滋养体，提取DNA用于PCR反应。琼脂糖凝胶电 泳后紫外灯下观察，见到约350bp大小的DNA条带为聪性。其余的 肺组织保存于一20℃备用。t 纺暴：病原学检查结暴显示成功建立了PCP动物模鳖。检测结暴显 示，吉氏染色检出率为80％，快速银染检出率为sO％，PCR检出率 为95％，后者绢显高于吉氏染色和快速银染法。PCP动物模型的诱 导成功及肺组织的获得为后续的实验研究奠定了基础。 南京医科大学硬士学饺论文 2．心特异性目的基因的获得及序列测定： rRNA)基霹。 规PCR扩增＆的线粒体核糖体RNA大亚基(LSUmt ／琼脂糖凝胶电泳后将含有约350bp走小DNA条带的凝胶切割，网收 其中DNA片段。将辑鬻基蘧片段i妥}}亭，采爝Blast较件将该段基霞 序列与GeneBank中已公布序列比对确认所得基因的来源。』 基溺的同源性为99％，故确认是n特异的藩因，f该基因的获得及鉴 定麓探针的裁备及检测提供了必需舔榜释，并保蟊了探舒晦跨雾蛙。 3．托特异性DNA探针的制备及其舞睑应用扩 救荻褥翡瓢特募撼DNA为模掇，采丽篷枫荸{耱法番垂备遗高辛 标记的非放射性探钟。以已知浓度馥地高事标记的DNA为参照确定 探钎的浓度，随烯检测该探针的特异I}盛和敏感性。f将该探针用于斑点 杂交检测欠鼠蹄组织紊’簪移辕并发PCP患者￡气管醛泡灌浇浚 (bronchoalveolar lavage，BAL)标本中的PcDNA。上一 凳暴：实验中瑟得探针浓度秀30ng／uI，显龟；敏感畦为tpg，杂交敏感 性为2pg，特异性检测显示该探针不与小鼠伯氏癌原虫、人恶性癌原 虫、弓形擞、正常人白细胞和照常宿主(夭鼠)肺组织DNA反成， 仅与PcDNA反应，杂交君显色蠢现紫红色斑点。褥该拣针廷亍斑点 杂交检测大鼠模型肺组织中的pc，检出率为73．7％，肾移被并发PCP 患孝翡BAL禄本中未检测鹫PcDNA。将这些标本采震PCR扩增后 结合杂交嬖新检测，检出率为9|4。7％，在肾移植并发PCP患者的BAL 中检出PcDNA。 v+一 t，～ 关键强 卡氏醛翘子虫专＆y 卡氏蓐施子虫蹿秀(pcv{ 斑点杂交 太鼠模型v PCR、，DNA探针． ／、X 7 南京医科大学硕士学位论文 and