间接ELISA检测抗氨苄青霉素抗体方法建立.docxVIP

间接ELISA检测抗氨苄青霉素抗体方法的建立*杜根成1,陈 陆1 ,刘 涛2,杨智洪1,王川庆1*（1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002；2.信阳农业高等专科学校，河南信阳 464000）摘 要：通过对最佳抗原包被浓度及包被条件、最佳血清工作浓度、封闭剂、待测血清、酶标二抗的最佳工作浓度及作用时间等反应体系的筛选和确定，利用人工制备的完全抗原及其免疫血清建立了检测抗氨苄青霉素(AMPI)抗体的间接ELISA方法。结果表明，AMPI-BSA抗原最佳包被浓度为1 μg/mL，AMPI-HSA抗原最佳包被浓度为2 μg/mL；包被条件为37 ℃ 4 h后4 ℃过夜；抗AMPI-HSA血清和抗AMPI-BSA血清最佳工作浓度分别为1∶25 600和1∶51 200；封闭剂、待测血清、酶标二抗的最佳作用时间均为30 min。血清检测结果表明抗AMPI-HSA的抗体水平最高，抗AMPIBSA的抗体水平稍低于抗AMPI-HSA的抗体，而抗AMPI-KLH的最低。关键词：氨苄青霉素;抗体检测;间接ELISA随着生活水平的不断提高，人们对食品安全性的要求也越来越高，而目前多种原因导致抗生素在肉、蛋、奶中严重残留，给人类的健康带来很大的危害。因此，建立一种快速、特异、灵敏、操作简便的抗生素残留检测方法，成为当务之急。免疫学检测方法是目前公认的比较特异、灵敏的方法。氨苄青霉素(Ampicillin, AMPI)免疫学检测方法建立的关键是抗AMPI特异性抗体的获得，但AMPI不是完全抗原，只有抗原性，没有免疫原性，必须和载体蛋白结合，制备成完全抗原才能用于免疫。作者将半抗原AMPI分别与牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白(HSA)、血蓝蛋白(KLH)等载体相连接制备成完全抗原后免疫小鼠，获得了特异性抗体,并建立了检测抗AMPI抗体的间接ELISA方法，取得满意效果,为筛选分泌抗AMPI的杂交瘤细胞株打下了良好的技术基础,现报告如下。1 材料与方法1.1 仪器及试剂酶标板为长沙沙善生物工程公司产品，酶标仪为Bio tek公司产品，戊二醛、BSA、HSA、KLH、TMB均为Sigma公司产品，过氧化氢脲素和酶标二抗（HRP羊抗鼠IgG）为华美生物工程公司产品。1.2 ELISA使用溶液的配制包被液、封闭液、洗涤液、样品稀释液、底物液、终止液按文献[1]配制。1.3 血清制备阳性血清：小鼠免疫4个月后，断尾采血制备血清，-20 ℃保存备用。阴性血清：非免疫小鼠，断尾采血制备血清，-20 ℃保存备用。待检血清：从免疫小鼠断尾采血制备血清，编号标记后，-20 ℃保存备用。1～6号为抗AMPI-BSA血清,7～12为抗AMPI-HSA血清，13～18为抗AMPI-KLH血清。1.4 人工完全抗原的制备半抗原与载体蛋白的连接按文献[1-2]方法并稍做改进后进行。取适量AMPI和BSA加入到0.067 mol/L pH6.0的PBS中，充分溶解后，缓慢加入适量戊二醛，并不断摇动，37℃避光反应4h～6 h，期间每隔30 min轻轻晃动一次，使之充分反应后置4 ℃过夜。然后用0.067 mol/L pH6.0的PBS透析48h，分装后-20℃保存备用。以HSA和KLH为载体的完全抗原制备方法同上。3种完全抗原分别用AMPIBSA、AMPIHSA、AMPIKLH表示，抗原浓度以蛋白的浓度计算。1.5 间接ELISA操作流程按参照文献[3-4]介绍的方法设计ELISA操作流程，具体步骤为：①抗原包被；②封闭液封闭；③加待测血清；④加酶标二抗；⑤加底物；⑥终止反应,测定OD值.每个步骤之间均用洗涤液洗涤3次，每次洗3 min，每种试剂加入的体积均为100 μL。在OD值接近1.0时，以P/N值在2.0以上并呈现最大者的反应条件作为确定ELISA最佳反应条件的判定依据。1.6 抗原最佳包被浓度的确定采用方阵滴定法，将抗原用包被液分别稀释成8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL和0.25 μg/mL后，包被。阴性、阳性血清分别作1∶6 400、1∶2 800、1∶25 600、1∶51 200倍稀释。1.7 抗原最佳包被条件的确定以抗原最佳包被浓度包被板子，按37 ℃ 4 h、37 ℃ 4 h后4 ℃过夜、37 ℃ 2 h后4 ℃过夜、4 ℃过夜4种条件分别包被。将阴性、阳性血清作1∶6 400稀释。1.8 酶标二抗最佳工作浓度的确定将HRP羊抗鼠IgG分别作1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000倍稀释，测定其OD值。1.9 封闭剂、血清和酶标二抗最佳作用时间的确定用15 g/L明胶PBST作为封闭剂， 37 ℃分别封闭30 min、45 min、60 min；阴性、阳