分子信标生物芯片的制备与杂交.pdf

摘要 淹骜燕耪技零魏发最，基因芯片歼殆终先一释常麓检潮技零在疾病捡测与诊精方蠢褥翱 碰用。基因芯片检测技术是一种大规模、高通量、高灵敏度、快速、可靠的检测技术，但是 现有依靠荧光硷测的基因技术大多要求样品标记，样品标记不仅费时费力、费用嚣贵，而且 餐易引起样品结构活性的改变，降低了实验绻果的可靠性。现糍的非标记检测投术无法实现 大规模并彳亍检测，而且对小分子DNA序列的梭测灵敏度不高。 霾是{乏分子攘糠擞瘁裂传鐾器岛一般检测落冀攘魄，鸯诲多忧蠢；不雾要称记蕤序裂， 不会改变靶序列在样品中的原始表选；不需瓣清洗．末结合的靶序列甜荧光背景没有任何 影璃。分子售标懿褥蛙保谜了发夹缝德斡热力学稳定魏，可黻实畦捡溅杂交遴搂；蠢且客 对单碱基错配序列的识别灵敏度高，对错配的类型和位置没有要求，使得探针的设计更为 麓单。 但是分子信标的固定埘奠空间结构具有一定影响，固液界谢使得分予信标的发夹结构不 够稳定，荧光淬灭不完全秘致裙始状态荧光赞录较强，因蔼与宪垒匿酝痔剜杂交屠魏荧光 强度增加倍数不如来固定的探针高。 为此，本文对如何降低分子信标固定化所带来的负面作用进行了深入的实验研究，以期 攫赢信噪比。硬究缡果表明通过在载玻片表联修饰一层水凝胶薄膜，可为固定在其中的分子 佰标提供一个近{阻液相的环境，有效的解决了分子信栎童接固定在玻璃寝面对，阉液界面目{ 起的空间构像改变以及分子热力学等问题。 我们酋先设计了用于固定在圄相载片上的具有独特结构的分子信标。其特点摆在分子惰 器5’端荧光素霞壁寒翡修馋毒20令疆基的髓腺瞳嚏(1)捧必学譬分子，势在衷壤修馋毒爨 基，通过澎成席夫碱可将该信标分子阐定在修饰改性的璩脂糖或浆丙烯酰凝胶膜中。这20个 碱基斡鼹躲噻睫可竣提离分子售标熬黎镪性，驻萋减少?5’端裁定对分予绩标发夹式缝稳稳 宓性的影响。然后我们优化了琼月g耱和聚丙烯酰水凝胶膜的制备、修饰荣件，戚勘她在玻片 袭覆修馋了用于固定分子信栝镦阵列的璩￡l糖凝胶貘帮聚弱爝魏胺凝胶艨，具体分褥了它靛 的性质，并在起上制备了分予信标微阵列。将制备的分子信标与靶序列杂交盾，缀然完全趿 酝搽锋与攀碱基锩既探舒的荧光强度瀵僮眈没蠢渡朝拜凌中的犬，但是仍可明显然分出完垒 腻配序列殿单碱基错配序列。通过实时观测分子信标微阵列杂交过程，阐定在琼脂糖凝胶膜 和聚雨烯歉胺凝胶羰上的分子信标微阵列杂交蘑的结豢表明；隧羞时闼的延长，宠全互{}序 列和单碱基错配序列的区分变得愈加容易。杂交完成崩，完全旺配的探针荧光强度比单碱基 锩配的增强了三倍寥。两在簧通改性载玻片上，正配与单碱基锚配的杂交荧光僖母强度比避 常只有l／(0．5．o．75)。上述结果可以归因于这两种凝胶膜具有良好的孔性结构，它们在反应过 程中为分子信标微阵列提供了近似液相的环境，从而保证了分子信标的高特异性。在实验中 我们还发现，由于琼脂糖凝胶膜的孔系结构更为发达，不仅表现出较高的固定能力，而且在 杂交过程中立体空间阻碍较小，因而对分子信标探针的固定能力较聚丙烯酰胺膜强，为区分 完全匹配序列和单碱基错配序列所需反应时间也较短，而且两者的荧光强度差别更为明显。 上述结果表明，这两种凝胶膜，尤其是琼脂糖凝胶膜，可望在基因组水平上应用于大规模、 高通量的基因分析。 ’’．一 ABSTRACT A isacollectionofminiatudzedtestsites onasolidsubstretethat microarray arranged tobe ina andata tests highthroughputhighspeed． permitsmany performedsimultaneously aretheRNA and Mostofthe ofthe