肝素酶表达与胃癌生物学行为关系研究.pdfVIP

中文摘要 前 言 i ／胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，在我国不少地区的恶 l 性胖瘤的死亡率统计中，胃癌居于首位。侵袭和转移是胃癌的重 要生物学特征之一，也是决定胃癌预后的关键因素。随着淋巴结 清除术的规范和推广以及综合治疗技术的应用，胃癌的治疗效果 有所提高，但对其生物学行为的判定尚缺乏有效的分子生物学指 素酶的表达情况，探讨其表达与临床病理特征之间的相互关系，以 期为临床早期判定胃癌的生物学行为以及胃癌的治疗、预后提供 客观有用的指标。 f方 法 1．应用免疫组织化学sP法检测胃癌组织肝素酶表达情况。 所有组织均来源子中国医科大学第一临床学院1999年3月 一2002年8月外科手术切除标本，其中早期胃癌10例，进展期胃 癌132例，癌旁组织20例。免疫组化染色方法采用霉菌抗生物素 一过氧化物酶法(SP法)，第一抗体是羊抗人的肝素酶多克隆抗 体，为美国D ZYNE公司产品。染色过程中采用即用型免疫组 织化学超敏S—P试剂盒，购自福州迈新生物技术开发公司。免 疫组化染色操作如下： (1)切片脱蜡和水化； (2)3％H：O：室温下孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶 的活性； (3)高温高压抗原修复； (4)非免疫动物血清37℃封闭20分钟； (5)肝素酶抗体4℃孵弯，过夜； (6)生物素标记的第二抗体37℃孵育20分钟； (7)即用型S—P复合物37℃孵育20分钟。每步骤间用0． 01M的PBS(PH=7．2)缓冲液洗3次，每次5分钟； (8)新鲜配制的DAB溶液显色； (9)苏木素复染，中性树胶封片。已知阳性片作阳性对照， PBS替代一抗作空白对照。结果判定：肝素酶以肿瘤细胞浆出现 明显的棕黄色颗粒为阳性表达，并分级如下：阳性细胞数20％为 ++)。 2。RT—PCR 采用TRlzol试剂一步法从100mg冷冻胃癌组织中提取mR· NA，Dnase 扩增，取10止PER产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染 色。同时以13一aetin作内对照。 3．统计学分析采用x2检验，Po．05为差异有显著性。 结 果 1．免疫组织化学肝紊酶在胃癌组织中的表达 肝紊酶表达定位于细胞浆，呈棕黄色颗粒。20例癌旁组织均 无阳性表达，早期胃癌表达率只有20％，进展期胃癌表达率较高 (78．0％)；有淋巴结转移组表达率(80．5％)明显高于无淋巴结转 移组(30．3％)，二者差异有显著性(PO．05)。进展期胃癌随着 ·2· 癌组织侵犯深度增加，其表达率呈上升趋势(浅肌层48．1％、深肌 层72．7％、浆膜层94．I％)，统计学分析不同深度的表达具有差异 性(PO．05)。肝素酶在高、中、低分化腺癌、粘液腺癌、印戒细胞 癌的表达率分别是42．9％、52％、47．4％、55．6％、56．3％，差异无 显著性(PO．05)。 2．RT—PCR 8例胃癌组织RT—PCR检测，5例伴淋巴结转移的胃癌有4 例肝素酶mRNA阳性表达，3例无淋巴结转移者均阴性表达。 讨 论 1．肝素酶与肿瘤的关系 近年来的研究认为，肝素酶是一种葡萄苷酸内切酶，是目前已 确定的HSPG降解酶，在内皮细胞、血小板、中性粒细胞等有活性 表达，在非免疫组织不表达。本研究中，癌旁组织粘膜上皮均无表 达，与文献报道一致。 2．肝素酶与胃癌侵袭和转移的关系 大量研究资料发现，硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)在组织 形态发生、血管形成及上皮一间皮细胞相互作用等方面发挥了重 要作用。HSPG由蛋白核心和硫酸肝素(I-IS)侧链构成，是ECM， 尤其是BM的主要组成成分。因此，其相应的水解酶在肿瘤细胞 侵袭和转移过程中具有不可忽视的作用。最近，随着肝素酶基因 得以克隆，它在肿瘤发展过程中的作用越来越受到研究人员的关 注。 胃癌细胞侵袭和转移的潜能与其产生肝素酶的量密切相关。 本研究结果显示，