灰葡萄孢除草活性菌株的诱变及其相关基因的差异显示.pdf

摘要 狄葡萄孢产生的毒素具有除草活性，有望开发成微生物除草剂。本试验以狄 葡萄孢Bc4菌株及由其诱变得到的突变菌株为材料，比较其所产毒素的除草活性 及所含除草活性物质的差异，并对调控获葡萄孢除草活性物质产生的相关基因进 行了研究，结果如下： 1．以扶葡萄孢Bc4为出发菌株，通过紫外线和化学诱变剂诱变分生孢子， 共获得50个菌株。经种子萌发法和茎叶处理法筛选，得到所产毒素除草活性比野 生菌株显著增强的3个突变菌株B1、B2、B3及除草活性几乎丧失的2个突变菌 株B5、B23。 2．摸索色谱条件，对各菌株产生的毒素进行HPLc分析，发现Bl、B2、B3 等突变菌株中各组分的含量均显著高于野生菌株，其最大吸收峰高均在野生菌株 的5倍以上。而菌株B5、B23毒素中各组分含量与野生菌株相比明显下降，两者 最大峰高值仅为BC4的39％和34％。遗传稳定性试验表明，供试菌株遗传稳定， 连续培养8代除草活性未变化。优化HPLc条件对强除草活性毒素进行分离纯化， 制备了4个组分，其中组分I和Ⅳ对马唐及反技苋具有很强的杀除活性。 3．利用mRNA差异显示反转录技术对野生菌株Bc4和部分诱变菌株进行差 异显示分析。对狄葡萄孢不同菌株表达的基因差异片段进行了分离、再扩增，通 过反式Northem杂交技术检测，筛选出阳性片段，进行克隆、测序和分析。 本试验建立了狄葡萄孢菌株mIⅢA差异显示的体系，利用3种锚定引物和26 种随机引物组合，展示了不同扶葡萄孢菌株基因片段表达的差异。通过强除草活 性菌株与弱或无除草活性菌株问的比较，共得到81个差异片段。将差异片段回收 纯化后，以相同条件及对应引物进行二次扩增，均能得到有效的扩增片段。经反 式Nonhem杂交检测，筛选得到30个阳性片段。对其中5个差别表达基因片段进 cDNA序列，利用Blast软件进行序列同源性分析，发现片段49与钙／钙调素依 赖性蛋白激酶等具有较高的同源性。 ofcDNAends，RAcE)技 4．利用cDNA米端快速扩增(rapidamplification 术对前期获得的基因片段49的5’端未知序列进行扩增。根掘片段49的cDNA序 列，设计特异性引物，进行5’RAcE反应，得到了一个1648bp的片段。与原片段 序列进行拼接从而使其延长到2055bp。它与钙／钙调素依赖性蛋白激酶，Tl认PP subunit compIexBet5等蛋白具有较高的相似性。 关键词：次葡萄孢；除草活性；mRNA差异显示法：cDNA术端快速扩增 Diffe代ntiaIOfHerbicidal-related Mutationand DispIay G蚰髓ot Bot删妇cineren Author：MAJuan Supervisors：DONGJin-gao ZHANGJin．Iin Major：PlantPalh010蹦 Abstract It、vas that be as rcponedmycotoxinstiom口D，∥协cmP胛口candeVeloped microbialherbicidesduetotheir herbicidal high bioactivity．However，thetoxigenic mechanism notclearat he心dity of曰of秽出cf玎F地口is presem．The如ngi口D打yf括cme阳口 mouId．Inthis arId也e isaknown oftomato