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实验原理 DPPH 在有机溶剂中是一种稳定 的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在可见光区最大 吸收峰为515 nm[17-20]，当DPPH 溶液中加入自由基 清除剂时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱。因 此可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质 的抗氧化能力。其作用原理如图1。 图1 DPPH 自由基清除作用原理 Fig. 1 Principle of DPPH free radical scavenging 1.2.6 DPPH 自由基清除试验的测定方法 将每种 供试品溶液分别取20 μL 加样在96 孔板中，再在每 个孔中平行加入180 μL DPPH 溶液。同时设立对照 组（等量乙醇代替供试液），空白组（20 μL 乙醇加 入180 μL DPPH 溶液）。轻轻振荡，使充分混匀， 将96 孔板放置在避光环境下反应30 min。药物与 自由基反应完全，在波长515 nm 处测定，记录最 终吸光度（A）值。 自由基清除率D=（A 对照组?A 样品组）/（A 对照组?A 空白） 式中A 样品组为加入测试样品后反应液的吸光度；A 对照组 为对照组未加药的吸光度；A 空白为空白组的吸光度。为了减 小实验误差，每样品设6 复孔，6 复孔取平均值。 DPPH·(二苯代苦味酞自由基)在有机溶 剂中是一种稳定的自由基,其孤对电子在 sl7nm附近有强吸收(显深紫色)。当有机清 除剂存在时,孤对电子被配对,吸收消失或减弱, 通过测定吸收减弱的程度,可评价自由基清除 剂的活性。DPPH·法用以评价天然抗氧化剂 抗氧化活性的一种快速(反应时间仅需20min 左右)、简便、灵敏可行的方法。 原理:DPPH·(二苯带苦基麟基自由基)是 一个大分子的稳定自由基抗氧化剂预期作用 模式为:AH十DPPH·~DPPH一H十A·依 据DPPH·具有单电子,在517nm处有一强吸收 (深紫色),当自由基清除剂与其单电子配对使 其吸收逐渐消失,其褪色程度与其所接受的电 子数成定量关系,因而可用分光光度法进行定 量分析[91。 抗氧化剂（物质） 测定波长515 nm （电离溶液） 2.1.1 DPPH 标准曲线的绘制 分别吸取1、2、4、 6、8、10 mL DPPH 对照贮备溶液，定量转移至10 mL 棕色量瓶中，乙醇定容，摇匀。精密移取200 μL 加 入96 孔板中，515 nm 测其A 值。以质量浓度为横 坐标，A 值为纵坐标，绘制标准曲线，每个质量浓 度重复3 次，取平均值。得回归方程A＝10.88C＋ 0.075（r＝0.999 6）。 有机化合物的热氧化过程是一系列的自由基链式反应，在热、光或氧的作用下，有机分子的化学键发生断裂，生成活泼的自由基和氢过氧化物。氢过氧化物发生分解反应，也生成烃氧自由基和羟基自由基。这些自由基可以引发一系列的自由基链式反应，导致有机化合物的结构和性质发生根本变化。抗氧剂的作用是消除刚刚产生的自由基，或者促使氢过氧化物的分解，阻止链式反应的进行。能消除自由基的抗氧剂有芳香胺和受阻酚等化合物及其衍生物，称为主抗氧剂；能分解氢过氧化物的抗氧剂有含磷和含硫的有机化合物，称为辅助抗氧剂。 一胡萝卜素是一种多烯色素,易被氧化 而褪去黄色。在反应介质溶液中,由亚油酸氧 化产生的过氧化物等能使p一胡萝卜素漂白, 随时间的延长吸光度越来越小。当以吸光度对 时间作图时可得到一条下降曲线。不同原料的 溶剂提取物,按其抗氧化活性的大小不同而使 p一胡萝卜素漂白的速度各异。抗氧化能力越 强,吸光度下降越慢。因而不同的曲线有不同 的斜率。抗氧化能力越强的,曲线斜率绝对值 越小。 邻苯三酚自氧化法 邻苯三酚在碱性条件下会自动氧化,不断 释放出价·,价·又会进一步促进自氧化过程, 生成有色中间产物,先生成的中间产物又不断 被氧化成其他中间物,由此邻苯三酚在自氧化 过程中出现一系列的颜色变化。在邻苯三酚的 自氧化初期,中间物的积累浓度(或吸光度) 在反应开始30一455后与时间呈线性关系,一般 线性时间维持4min左右。因此通过测定不同时 刻自氧化中间产物的吸光度,并对时间作图, 可求得邻苯三酚的自氧化速率,当向体系中加 入抗氧化活性物质时,同样可求得。戈的抑制 率I,41。 氮蓝四哇(NBT)法 o气可使NBT还原成蓝色的化合物,其最 大吸收波长为560nln,吸光系数达10000以上, 测定灵敏度相当高。同时,o入在H十作用下会 被歧化成HZOZ。在反应体系中若没有抗氧化活 性物质存在,则。灰的歧化反应很慢,有抗氧 化活性物质就会加速歧化反应,因而蓝色化合 物的生成量就会减少,所以通过反应体系的吸 光度随时间的变化可以测定蔬菜的抗氧化活 性[,5]。 氧自由基吸收能力(ORAC)分析法 p