再生障碍性贫血患者治疗前后外周血中单个核细胞FOXP3水平的检测及其意义.pdfVIP

· 316 · 山西医药杂志 2009年 4月第38卷第4期上半月 ShanxiMedJ，April2009，Vo1．38，No．4theFirst · 研究生论坛 · 再生障碍性贫血患者治疗前后外周血中单个核细胞 FOXP3水平的检测及其意义 山 西 医 科 大 学 (030001) 孟丽娟 山西医科大学第一医院 张秀莲 张伟华 范星火 陈 玮 侯素敏 刘 晨 CD4 CD2l5调节性 T细胞 (CD4 CD25Treg)在维持 tion1 L，无 RNA酶水 (0．1 DEPC水)5～8 L；反应条 自身免疫耐受及阻止 自身免疫反应的发生中所起的重要作 件为 42℃ 1h，95℃ 5min灭活反转录酶 。 用被 日益关注。转录因子 (forkheadboxP3，FOXP3)特异性 1．2．4 RT-PCR检测 FOXP3mRNA表达 ：FOXP3引物 表达于CD4 CD25 Treg，与 CD4 CD25 Treg的生长发育 上游序列为 5一AAGGAAAGGAGGATGGAC 3，下游序 和功能维持密切相关L】]。有研究报道，重度再生障碍性贫血 列为 5一TGTGGCTGGTTGTGAAGG一3；~-actin引物上游 (SAA)患者外周血中CD4CD25 Treg减少 ，不能抑制 自身 序列为 5-CACGATGGAGGGGCCGGrACTCATC-3，下游 反应性 T细胞 的活化增殖，导致免疫耐受被打破，骨髓造血 序列为 5-TAAAGAcCTCTATGcCAACAcAGT一3，扩增 功能衰竭[2]。本研究利用反转录聚合酶链反应 (RT_PCR)方 产物长度分别为 288bp和 250bp。以随机引物 9为引物 法，分析再障患者FOXP3的水平，以期从免疫耐受方面探索 反转录合成 eDNA，加入 5 L模板 eDNA于2O LPCR反 啪 3在再障患者发病机制 中的作用 。 应体系 中按 36个反应循环数进行扩增 ，~-actin扩增条件为 1 材料与方法 94℃变性 20S，56℃退火 30S，72℃延伸 30S，F0xP3扩 1．1 材料与试剂 增条件为 94℃变性 20S，56℃退火 30s，72℃延伸 30s， 1．1．1 材料 ：20例新发再障病例均来 自2007年 8月至 扩增产物用含 0．5ng／L溴化 乙锭 的 1．5g／L琼脂糖凝胶 2008年 11月我 院血液科就诊的门诊及住 院患者 ，其 中男 电泳显示 ，以DNA相对分子质量标志物为标准，电泳完毕 性 13例 ，女性 7例 ，年龄 18～46岁，中位年龄 27岁，诊断 后在紫外灯 下观察条带并照相。凝 胶 电泳扫描图像用 均符合全国再障的诊断标准。其中未治疗组 6例 ，治疗组 Photoshop软件进行分析 ，比较 FOXP3与 13-actin的相对值 14例中，免疫抑制剂 (IST)治疗后恢复组和未恢复组各 7 并进行半定量分析 ，每个样本均检测 3次 。 例 。1O名健康者作为研究对照组 。取材为外周血 。 1．3 统计学处理 1．1．2 主要试剂 ：人淋巴细胞分离液购 白天津市灏洋生物 采用 SPSS11．5软件分析 ，结果 以i士s表示 。均值 比 制品科技有限责任公司。RT—PCR试剂盒购 自Fermentas 较用 t检验 ，配对数值用配对 t检验 ，数值的直线相关性用 公司。引物由上海生工有限公司合成 。 Person分析法 。 1．2 实验方法 2 结 果 1．2．1 外周血单个核细胞 (PBMC)的分离：分别取健康对 2．1 再障患者外周血 FOXP3mR