盐生杜氏藻MAPK基因克隆及对烟草转化.pdfVIP

Y937291 中文摘要 促分裂原活化蛋自激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)属于丝氨 酸／苏氨酸(Ser／Thr)蛋白激酶，存在于所有真核生物中，通过对丝氨酸／苏氨酸的 磷酸化修饰将上游信号传递至下游，对细胞周期的运行和基因表达具有重要调 控作用。近年来，越来越多的实验研究表明：MAPK在植物生长发育调节和抗 逆等生理过程中超重要作用。而现今逆境胁迫严重影响植物的生长，因此提高 植物抗逆性的研究有着极为重要的现实意义。本实验利用传统的同源克隆方法 成功克隆到盐生杜氏藻MAPK基因，并构建了植物表达载体pBll21．MAPK， 将其转入根癌农杆菌EHAl05中，然后通过农杆菌介导将其导入烟草中，并对 转基因烟草进行检测，借以初步探讨MAPK基因在烟草中的转化情况，为今后 在更多牧草上应用提供了依据。本实验内容和结果如下： 1．盐生杜氏藻MAPK基因的克隆 利用同源克隆的技术，从盐生杜氏藻中克隆到一条MAPK基因的eDNA片 段(297bp)，然后以该片段为基础，利用RACE技术构建其全长序列。 2．植物表达载体pBIl2I-MAPK的构建 利用DNA重组技术，构建植物表达载体pBll21．MAPK，然后将其通过冻 融法导入根癌农杆菌EHAl05中。 3．烟草再生体系的建立 采用烟草叶片为外植体，以MSo为基本培养基，筛选出MS0+6一BA(2rag／L) +NAA(O．1 mg／L)以诱导不定芽的分化，并于MSo+NAA(O．2mg／L)生根培养 基上生根，获得完整的再生植株。其叶片分化率达52．4％，生根率达88．5％。 4．转化体筛选及植株再生 将预培养2d的烟草叶片用农杆菌菌液浸染10min，共培养2d，然后转化到 50 mg，L、75 含Kmmg／L的选择培养基上进行分化筛选，再转入Km为50 mg／L 的培养基上进行生根筛选，生根率达64．8％，获得转基因植株。 5．转基因烟草分子生物学检测 对转基因烟草苗的PCR检测结果显示，有17．6％的再生苗为阳性，测序结 果正确，说明pBIl21一MAPK已经整合到烟草基因组中。 关键词：盐生杜氏藻；同源克隆；MAPKRACE．叶盘转化；转基因烟草 Summary kinase toSer／Thr kinasesandeximin Mitogen—activatedprotein belong protein transmit todownstreammeansof eucaryota．Itupstreamsignal by Phosphorylation ofSer／Thr avitalrolein the ofcell and position，playingregulatingoperationcycle andmore anddatasindicated geneexpression．Recently,more experimentalproofs ithas effectson and that very plantgrowth wellasstress important development，as resistance．Plantis affectedstress makes growthseverely by enviro