第四节膜载体的酶免疫测定固相膜免疫测定（solidphase.pptVIP

　　　　第四节　膜载体的酶免疫测定　　 固相膜免疫测定（solid phase rnembrane－based immunoassny）与固相酶免疫测定（ELISA）相类似，其特点是以微孔膜作为固相。标记物可用酶和各种有色微粒子，如彩色胶乳、胶体金、胶体硒等，以红色的胶体金最为常用。固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样。固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行。利用这种性能建立了两种不同类型的快速检验方法。常用的固相膜为硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜。 　　在固相膜免疫测定中，有穿流形式的，称为免疫渗滤试验（immunofiltration assay，IFA）；横流（lateral flow）形式的，称为免疫层析试验（immunochromatographic assay，ICA）。 　　斑点-ELISA（dot- ELISA）实验原理与常规ELISA相同，不同之处在于斑点一ELISA所用固相载体为对蛋白质具极强吸附力（近100％）的硝酸纤维素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC染色。 　　免疫渗滤试验（IFA）的基本原理是：以硝酸纤维素（NC）膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。渗滤装置是IFA中的主要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。 　　免疫层析试验（ICA）是继IFA之后发展起来的另一种膜固相免疫测定。与IFA利用微孔膜的过滤性能不同，ICA中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般。 第五节 酶免疫测定的应用 第十二章免疫组织化学技术 　　　　 第二节　酶免疫组织化学技术 　酶免疫组织化学技术（enzyme immunohistochemistry technique，EIHCT）是利用酶标记已知抗体（或抗原），然后与组织标本中相应抗原（或抗体）在一定条件下相互结合形成带酶分子的复合物，酶遇到底物时；能催化底物水解，或氧化或还原，产生有色的不溶性产物，出现显色反应，在显微镜下进行细胞与组织表面或内部某种抗原成分的定位观察分析。 　最常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。 （一）直接染色法（一步法）1 原理 用酶标抗体直接与处理过的组织标本中相应抗原反应，继用底物二氨基联苯胺（diahanobenzidine，DAB）和 H2O2进行显色，产生的有色物质沉积在抗原抗体反应部位，从而对组织或细胞抗原定位、定性和定量。 2、操作步骤（1）标本处理；充分水洗后于室温用0.3％H2O2和80％甲醇处理20－30min，以去除内源性过氧化物酶的干扰。石蜡切片要求消除内源酶和用胰蛋白酶或胃蛋白酶消化处理，然后用PBS洗涤。（2）用正常血清或牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液处理，以封闭非特异性结合点，阻断组织细胞与抗体的非特异性结合，减少背景着色。（3）加酶标抗体，孵育使之形成抗原－酶标抗体复合物，洗去未结合物。（4）加入底物，普通光学显微镜下观察显色结果。3、方法评价 （二）间接染色法（二步法）1、原理 　　该法是在直接法的基础上，为了增加敏感性和实用性而在酶标抗体与组织内抗原之间增加抗体反应层次。即先用未标记的已知抗体与标本中相应抗原反应，再用酶标抗抗体与之反应，形成抗原．抗体．酶标抗抗体复合物，加底物显色。根据底物显色反应对抗原定位、定性和定量。 2、操作步骤（1）用正常血清或BSA溶液处理标本，封闭。（2）加适当稀释的已知抗体，孵育，使之形成固相抗原抗体复合物，洗去未结合的已知抗体。（3）加酶标抗抗体，孵育，形成固相抗原－抗体－酶标抗抗体复合物，洗涤。（4）加底物，普通光学显微镜下观察显色反应。3、方法评价 　　　　第三节 荧光免疫组织化学技术一、直接法二、间接法三、双标记荧光免疫法　　许多细胞表面常有多种抗原存在，在同一细胞组织标本上需要同时检测两种抗原时，采用双标记荧光染色法．通常采用的是双标记直接染色法。 * 斑点酶免疫吸附试验 免疫渗滤试验 免疫层析试验 酶标记抗体免疫组化染色法 *