抗蓖麻毒素单克隆抗体6C2中和保护作用的结构基础及机制.pdf

目 录 摘要……………………………………………………一l— Abstract…………………………………………………．一3一 缩略词表…………………………………………………．一5一 前言……………………………………………………．一6一 第一部分抗蓖麻毒素单克隆抗体的筛选和体内外中和保护作用研究……．．一7一 一、实验材料……………………………………………．一7一 二、实验方法……………………………………………．一8一 三、实验结果……………………………………………一13一 四、讨论………………………………………………．一20一 第二部分6C2抗体识别表位鉴定及RTA-6C2Fab共结晶的结构解析……．．一21一 一、实验材料……………………………………………一21一 二、实验方法……………………………………………一25一 三、实验结果……………………………………………一30一 四、讨论………………………………………………．一38一 第三部分单克隆抗体6C2中和保护作用的结构基础和机制……………一40一 一、实验材料……………………………………………一40一 二、实验方法……………………………………………一4l一 三、实验结果……………………………………………一45一 四、讨论………………………………………………．一51一 全文总结…………………………………………………一53一 参考文献…………………………………………………一54一 综述…………………………………………………．．一57一 在读期间发表论文和参加科研工作情况…………………………．．一64一 致谢…………………………………………………．．一65— 抗蓖麻毒素单克隆抗体6C2中和保护作用的结构基础及机制 摘要 蓖麻毒素(Ricin)是存在于蓖麻籽油中的植物毒素。由A和B两个亚基组成， 并通过一条二硫键连接在一起。蓖麻毒素B亚基(RTB)是一种半乳糖特异性的凝集 素，能够结合细胞表面含糖脂或糖蛋白的受体。这些结合的毒素随后通过宿主细胞依 赖的内化机制和从内吞小体向内质网的逆向运输机制被运入细胞质。当蓖麻毒素A 链(RTA)转移到达细胞质后，它的糖苷酶活性位点能够识别rRNA，阻碍蛋白质合成 过程中的多肽延伸并导致细胞的死亡。因为其具有高致死和易于获得的特性，蓖麻毒 素被认为是一种可能被用于生化攻击的生物战剂。 目前，尽管已经发展出了多种针对蓖麻毒素的治疗方法，但特异性的中和抗体治 疗蓖麻毒素中毒仍旧是一种最特异和最高效的治疗方法。尽管目前已经发现了许多抗 蓖麻毒素的中和保护性抗体，其中和保护作用的机制往往仅局限于对己知功能表位的 阻断性抑制的探讨。对于中和保护性抗体发挥中和保护作用的结构基础则知之甚少。 本研究筛选得到5株抗蓖麻毒素A链单克隆中和抗体，其中6C2在蛋白质合成抑 制试验，vero细胞体外保护实验和小鼠体内保护实验中表现出很好的中和保护活性。 有趣的是我们经抗原表位淘选，发现其结合表位与已经报道的酶催化活性位点相距甚 远。 Fab—RTA 为明确6C2中和抗体的结合表位以及中和保护机制。我们进行了6C2 的共结晶实验。在3．0埃水平上解析了中和抗体6C2Fab和RTA复合物的共结晶的X 与RTA结合的关键位点。但SPR和pulldown实验证实，抗体6C2的结合仅能够降低 RTA与核糖体的亲和力。 我们进一步对抗体结合前后RTA的结构比对分析发现，6C2和RTA的结合会影响 化腺嘌呤切割的活性位点的关键氨基酸。对6C2结合的a螺旋区域进行柔性分析， 和RTA的催化活性成正相关。由此可推测，6C2与RTA的结合，可能通过降低a螺 旋的柔性从而抑制RTA的催化活性而发挥其中和保护作用。 基于以上研究成果，我们认为，6C2结合表位是一个全新的抗蓖麻毒素中和表位。 6C2的中和保护作用是通过影响RTA与核糖体的结合，同时改变RTA柔性抑制蓖麻毒 素催化活性两种途径协同作用实现的。本研究成果有助于深入理解抗蓖麻毒素中和保 第二军医大学硕士学位论文 护机制，并为抗蓖麻毒素中毒的抗体药物研发打下了坚实的基础。 关键词：晶体结构，蓖麻毒素，机制，中和保护抗体，生物战剂