胃癌组织VEGF、MMP-9和PCNA表达的相关性及其与胃癌生物学行为的关系.pdf

基底膜和细胞外基质的主要成份——Ⅳ型胶原酶，起骨架的作用，是降解基 底膜和细胞外基质成分的蛋白水解酶，可促进癌细胞对周围组织的浸润，在 肿瘤的浸润、转移及血管的生成中发挥重要的作用。具有转移倾向的癌细 胞可以自身分泌或诱导其他细胞分泌大量的MMP-9，破坏基底膜的完整 性，导致癌细胞向其他部位转移。血管发生极大的依赖于基质金属蛋白酶 的活性，肿瘤新生血管的生长也可为基质金属蛋白酶抑制剂所抑制。MMP． 9能上调肿瘤血管化的损害程度，是血管发生启动系统中重要的一员。 制及相互关系，探讨三者与胃癌生物学行为的关系。 材料与方法 1．临床资料 胃癌标本，均经病理学检查证实为胃腺癌。其中男32例，女18例。中位年 龄54岁。所有病人术前均未接受任何治疗。 2．标本采集 小，将一块标本装在一个小管中，10％的福尔马林保存液保存，并且使保存 液的体积为标本体积的4～5倍。标记小管，并在记录本上做标本登记。将 登记好的标本存于4℃冰箱中，一个月左右，集中数例标本用石蜡包埋一 次，石蜡切片厚度5微米，石蜡块长期保存。 3．主要试剂和仪器 鼠抗人血管内皮生长因子单克隆抗体，鼠抗人基质金属蛋白酶9单克 隆抗体，鼠抗人增殖细胞核抗原单克隆抗体，均购于福州迈新生物技术有限 公司。即用型免疫组化S—P试剂盒、EDTA抗原修复缓冲液购于福州迈新 生物技术有限公司。 4．方法 石蜡切片常规脱蜡、水化。 PBS洗3分钟X3次。 ．2． 修复液于烧杯中，放人盛水的电饭锅中，盖上锅盖进行热煮，至锅中水沸腾， 再将组织切片放在耐高温染色架上，放进烧杯中，注意组织片一定要完全浸 泡在EDTA溶液中，继续煮20分钟。煮好后，从锅中取出烧杯，室温下放置 20分钟，待冷却后从烧杯中取出切片。 蒸馏水洗3分钟X1次，PBS洗3分钟×2次。 每张切片加I滴过氧化酶阻断溶液(试剂A)，以消除内源性过氧化物 酶的活性，室温下孵育10分钟。 PBS洗3分钟X3次。 每张切片加1滴非免疫动物血清(试剂B)封闭消除非特异性染色，室 7 温孵育lO分钟。倾去血清，勿洗。 滴加一抗(鼠抗人血管内皮生长因子单克隆抗体／鼠抗人基质金属蛋 白酶9单克隆抗体／／J,鼠抗人增殖细胞核抗原单克隆抗体)，4℃过夜。 PBS洗，5分钟×3次。 甩去PBS液，滴加生物素标记的二抗(试剂c)，室温孵育10分钟。 PBS洗，3分钟X3次。 甩去PBS液，滴加链霉菌抗生物素一过氧化物酶溶液(试剂D)，室温 孵育10分钟。 PBS洗，3分钟×3次。 甩去PBS液，显色剂显色(DAB)。 自来水充分冲洗。 苏木素复染。0．1％HCL分化，PBS洗返蓝。 梯度酒精脱水。二甲苯透明，中性树胶封片。 5．结果判定 VEGF胞浆或胞膜呈棕黄、棕褐色颗粒者为阳性细胞。按染色强度和 阳性细胞数两方面来计算评分：a．染色强度(0=阴性，1=：弱阳性，2=阳 得分，得3—6分者评为免疫组化阳性。 MMP-9胞浆呈棕黄、棕褐色者为阳性细胞。阳性细胞10％为阳性表 达。癌细胞与基质中的纤维母细胞、单核吞噬细胞同时显示阳性颗粒的定 为阳性反应，如果只有基质中的纤维母细胞、单核吞噬细胞显示阳性反应而 肿瘤细胞阴性则定为阴性反应。 ·3· PCNA绝大多数阳性细胞以胞核棕褐色染色，部分也可胞浆着色。根 胞数，阳性细胞数占癌细胞总数的百分数为阳性细胞表达率，即为PCNA标 记指数(PLI)。 对照试验：阳性对照，用已知阳性片重复染色；阴性对照，正常胃粘膜片 染色；替代对照，用正常羊血清替代一抗。 6．统计学处理 检验。PLI的统计指标以叉±S表示，不同组闻PLI用t检验。 结 果 1．VEGF的表达 在癌细胞胞浆内，肿瘤血管内皮细胞也有部分表达VEGF。 2．MMP-9的表达 粒主要见于癌细胞胞浆中。 3．VEGF和MMP-9的表达及其相关性 计学有意义(P0．05)。