制备感受态的技术心得.docVIP

制备感受态的技术心得 1：要注意每次做感受态要摇过也菌，最重要的是在摇菌的过程千万不要被污染。2：其次是摇菌，要菌并不需要按照一定比例接，最重要的是收菌时候的OD600的值。这是极其重要的，也是很容易被大家忽略的问题，一般OD值达到0.42-0.48收菌是最好的。其次是方法：我做的方法是经过分子克隆上的INOUE法　我做的有一步和他的不同，而且是提高转化效率的主要关键，就是在最后一步是在菌液里加入０.１Ｍ氯化钙　再加入甘油　终浓度为百分之１４进行保重，在这里我就不做详细介绍了 我最后一步就是用0.1M cacl2 重旋保种,最近我做了连接转化的摸索实验,判定1:将片段和载体共同放入37度水浴1min以上.2:只将片段放入37度水浴1min以上,载体放再冰上,这样连接出来的转化效率比平常要高4-6倍, 反映体系中最好是有水,先把水和连接酶,连接buffer加再一块,再把载体和片段放在一块,最后再把两种混合物加再一块. 最后还是16度连接.大概6个小时就ok啦哈!这样做出来的连接转化率很高,虽然不知道阳性率有多少! 这也是我要下一步做的摸索,估计明天才会有结果. 分子生物学产品常见问题分析 问题 原因 解决办法 DNA完全没有被内切酶切割 1 内切酶失活 标准底物检测酶活性 2 DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子 将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA 3 条件不适（试剂、温度） 检查反应系统是否最佳 4 DNA酶切位点上的碱基被甲基化 换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株 5 DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I） 换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I ，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增 6 DNA位点上存在其它修饰 将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证 7 DNA不存在该酶识别顺序 换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证 DNA切割不完全 1 内切酶活性下降 用5-10倍量过量消化 2 内切酶稀释不正确 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 3 DNA不纯，反应条件不佳 同上 4 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰 同上 5 部分DNA溶液粘在管壁上 反应前离心数秒 6 内切酶溶液粘度大，取样不准 将内切酶稀释，增大取样体积 7 酶切后DNA粘末端退火 电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷 8 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性 使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡 9 过度稀释使酶活性降低 适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏 10 反应条件不适 使用最佳反应体系 11 识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序 加大酶量5-10倍 DNA片段数目多于理伦值 1 内切酶星状活性 检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量 2 其它内切酶污染 用λDNA作底物检查酶切结果 3 底物中含其它DNA杂质 电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段 酶切后没有观察到DNA片段的存在 1 DNA定量错误（如RNA含量较高） 用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量 2 在酶切反应液中形成非特异的沉淀 在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次 内切酶保存期内快速失活 1 保存温度不合适 内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存 2 以稀释形式保存 稀释酶液不宜长期存放，应一次使用 3 贮藏缓冲液不适当 使用厂家推荐的贮藏缓冲液 4 低蛋白浓度 内切酶与500ug/ml的BSA一起保存 电泳后DNA片段的带型弥散，不均一 1 DNA上结合有蛋白质 电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化 2 内切酶中含有DNA外切酶 减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶 酶切后的DNA片段连接效率低 1 含磷酸盐的浓度高 透析，乙醇沉淀去除磷酸盐 2 内切酶失活不全或含有ATP酶 延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA 3 平末端连接 加大T4 DNA Ligase用量 4 外切酶污染 减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA 5 连接缓冲液不合适 重新配制连接缓冲液 三、DNA分子量标准问题分析： 问题 原因 解决办法 带弱或无DNA带 1 上样DNA的量不够 增加DNA的上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高 2 DNA降解 避免DNA的核酸酶污染 3 DNA走出凝胶 减短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度 4 对于EB染色的DNA，所用