实验三考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度.pptVIP

2010版实验大纲 实验三 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 一.目的:掌握考马斯亮蓝G－250染色法测定蛋 白质的原理和操作. 二.原理 三.仪器与用具 四.实验试剂 五.实验操作 六 实验报告 二.原理: 三.仪器与用具 721分光光度计； 10 mL量筒1个； 研钵； 烧杯； 量瓶； 移液管：1 mL 3支，10 mL具塞刻度试管 四.实验试剂 标准蛋白质溶液： 用牛血清白蛋白配成(100μg／mL) 考马斯亮蓝G-250溶液： 称取100μg考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL 90％乙醇中，加入85％的磷酸100 mL ，最后用蒸馏水定容到1000 mL . 贮放在棕色瓶中，常温下可放置1个月。 五.实验操作 1.标准曲线(蛋白质含量为0～100μg／mL)的绘制　 牛血清蛋白溶液:浓度为100 μg／mL,按照表格配制  混合数次，放置5Min后，用1CM光径比色杯在595nm比色。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。 2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液1.0 mL( why?) ，放入 试管中 ，加入3mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置5Min后在595nm下比色，记录吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量。 注意事项: 1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为这段时间内颜色最稳定。 2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。 思考题： 试比较该法与其他几种常用蛋白质定量测定方法的有缺点。 (双缩脲法，Folin-酚试剂法，紫外吸收法，凯氏定氮法等） * * 测定蛋白质浓度范围为: 0～1 000μg／mL 蛋白质-色素结合物 保持稳定的时间2min-1h 建立者：1976年Bradford 特点：试剂简单，操作简便快捷，反应灵敏（比Lowry法高4倍） 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。蛋白质-染料复合物光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。 考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收488nm 当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。 洗涤：乙醇将蓝色的比色杯洗干净