实验三花粉的贮藏和生活力测定.docVIP

实验三 花粉的贮藏和生活力测定 一、目的和要求 在正常条件下花粉在雌蕊上萌发的能力，就是花粉的生活力。花粉生活力测定在杂交工作中很重要，尤其亲本花期不相同需要从外地采集花粉作父本时，花粉要经过一段较长时间的贮藏运输过程，因此在杂交前应检验花粉的生活力，以免应用无生活力的花粉而造成杂交工作的失败。 从生产上来看，在选择相互授粉的品种时，也应考虑到品种的花粉发芽能力，凡是花粉发育不全的品种，其花粉的发芽率都很低。因此不适宜做授粉品种。 本实验的主要目的是掌握花粉贮藏和花粉生活力测定的方法。 二、花粉及用具 材料：桃或苹果树的花粉。 用具：显微镜、天平、盖玻片、凹式载玻片、培养皿、干燥器、试管、滴瓶、蒸馏水、凡士林、蔗糖、氯化钙、琼脂、联苯胺、α-奈酚、碳酸钠、过氧化氢等。 三、方法 （一）花粉贮藏 从发育良好的植株上采下将开的花朵、取出花药放在纸上或培养皿中，放于干燥的室内，令其开裂，花药裂开后将花粉倒入小玻璃瓶或指形管中，口上塞以棉花或橡皮塞，贴上写有品种名称的标签。再把花粉瓶放于干燥器内，使花粉在空气相对湿度较低的条件下（一般0～40%）保存；为了减少呼吸作用，可以放在低温（0～4℃）黑暗的地方贮藏。 （二）花粉生活力试验 1、花粉发芽法 人为的创造适合于花粉发芽的环境条件，以花粉发芽的情况来鉴定花粉生活力的强弱，此法的缺点是花粉发芽条件与实际不完全相符，所得的结果与实际有一定的差异，但操作方便，能测定出相对发芽率来。 （1）培养基的制作与接种 一般采用5～20%蔗糖或葡萄糖加1～2%琼脂，溶于蒸馏水中。加热煮沸即可，将已配制好的培养基保持在40℃温度即不凝固，用玻璃棒点一点培养基敷在载玻片的凹坑内，然后用接种针或解剖针沾以少量花粉。轻轻振动，使花粉均匀地撒在培养基上，将载玻片放在垫有湿润棉花培养皿内或倒扣在培养皿上，并贴上标签写明处理、种类、播种日期，将培养皿放于20℃的恒温箱中培养。 （2）观察记数 在显微镜下隔一定时间检查一次（花粉发芽快的经过几个小时即可观察到已经发芽，慢的需24小时以上）若发现花粉已发芽时，便按一定方向，就同一视野中用记数器记录花粉粒总数和发芽数，观察记录3～5个显微镜视野的数字，求其平均数，即得出花粉发芽百分率。花粉发芽的标准，以花粉管伸长超出花粉直径为准。 2．染色法 （1）过氧化物酶测定法 原理：具有生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶。此酶能利用过氧化物使各种多酚及芳香族胺发生氧化而产生颜色，依据颜色可知花粉有无活力。 对二萘氧基联苯胺（紫红色） a．0.2克联苯胺溶于100毫升50%的酒精溶液； b．0.15克a-萘酚溶于100毫升50%酒精溶液； c．0.25克的碳酸钠溶解在100毫升的蒸馏水中。 以上三种溶液分别放入棕色瓶中备用，使用时将这三种溶液等量配成试剂Ⅰ，放入棕色滴瓶中备用，在使用前准备好0.3%的过氧化氢水溶液作为试剂Ⅱ。 使用时，先在载玻片上加少量待测花粉，然后在花粉上滴试剂Ⅰ和试剂Ⅱ各一滴，仔细搅匀，盖上盖玻片，经3～4分钟后，再放在显微镜下检查，有生活力的花粉呈红色或玫瑰色，无生活力的花粉为黄色或无色，为了确定具有生活力的花粉百分率，要连续观察3～5个视野，求其平均值，将观察结果填入表内。 （2）碘-碘化钾染色法 原理：正常的花粉积累淀粉较多，而不正常的花粉则少。据此，可用化学物质染色，根据呈色反应来间接测定花粉的正常与否和花粉生活力的差别。通常正常花粉用I-KI染色后呈蓝色，而发育不良畸形花粉则不积累淀粉，当I-KI染色时呈黄褐色。 步骤和方法：取花粉撒于载玻片上，加一滴蒸馏水，用镊子使花粉散开，再加一滴I-KI溶液，盖上盖玻片置于显微镜下观察，凡被染色呈蓝色表示具有生活力，呈黄褐色者为发育不良生活力弱的花粉。 （3）氯化三苯基四氮唑（TTC）法 原理：凡具有生活力的花粉，在其呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生活力的花粉则无此反应，因此当TTC渗入有生活力的花粉时，花粉中的脱氢酶在催化去氢过程中与TTC结合，使无色的TTC变成三苯基甲（TTF）而呈红色。 试剂配制： I．磷酸盐缓冲液 在100ml的蒸馏水中，溶解0.832克Na2HPO4·2H2O和0.273克KH2PO4，调整pH值为7.17。 Ⅱ．TTC溶液 称取0.02～0.05克TTC,溶解在10ml的磷酸盐缓冲液中,放入橡色滴瓶内,置于暗处。TTC为有毒物质,操作时应注意安全。 步骤和方法：取少量花粉放在载玻片上，在花粉上滴1～2滴TTC溶液，用镊子使其混匀后，盖上盖玻片。将此载玻片上置于恒温箱中（35～40℃）约15～20分钟，在显微镜（100倍）下观察。凡有生活力的花粉粒呈红色，其次呈淡红色，失去生活力的和不育的花粉粒表现无色。 四、作业 1．绘出花粉发芽前后形态图。 2．统计几种测定方法花粉发