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大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 作者：孙群 来源：上海交大生命学院 时间：2008-5-18 [实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知）细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37培养过夜，这样即可得到转化菌落。?[仪器、材料与试剂](一)仪器??? 1．小型高速离心机??? 2．恒温摇床??? 3．恒温箱??? 4．-20冰箱??? 5．恒温水浴器(二)材料??? 1．氨苄青霉素??? 2．大肠杆菌DH5a??? 3．pUC19??? 4．1.5mL 离心管??? 5．枪头、枪??? 6．试管、培养皿(三)试剂??? 1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）??? 2．LB培养液?????? 在950mL去离子水中加入：?????? 胰蛋白胨 (tryptone)????????????????? 10g?????? 酵母提取物 (yeast extract)????????????? 5g???? ?????? NaCl?????????????????????????????? 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121湿热灭菌20min。3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置-20冰箱保存。?[实验步骤]1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37振荡培养过夜。2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37振荡培养2小时。 以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。4．将上述细胞分装于1.5mL离心管 (离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。5．将感受态细胞迅速转移到-20或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。?转化：1．新鲜制备的或-20下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。3．冰上放置30分钟。4．42水浴热激60秒。5．冰上放置2分钟。6．加400mL LB培养液，37 250转／分振荡培养30分钟。7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。8．将细菌涂布在 Amp/LB琼脂平板上。9．平皿在37下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。?[实验结果]??? 经37培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每mg 质粒DNA 转化的菌落数表示。