三色法流式细胞术检测CD4+、CD25+调节性T细胞Foxp3的方法.docVIP

三色法流式细胞术检测CD4+、CD25+调节性T细胞Foxp3的方法 王琦1 张行1 邵雁2 陈大方1 陈萍1 曹江1 目的 为探讨甲状腺患者外周血中Foxp3+∕CD4 T细胞的表达及在甲状腺恶性肿瘤患者外周血手术前后的临床意义。方法 建立流式细胞术检测CD4+、CD25+调节性T细胞Foxp3的方法。 结果 外周血中Foxp3+∕CD4 T细胞平均比例，体检健康组为3.7629±1.9996%，甲状腺恶性肿瘤术前组为9.1492±6.4704%，术后组为7.4435±6.3587%。结论 甲状腺恶性肿瘤患者Foxp3+∕CD4 T细胞平均比例明显高于体检健康者（P＜0.05）。 而甲状腺恶性肿瘤患者术后Foxp3+∕CD4 T细胞平均比例则低于术前。 关键词: 、、Foxp3[1]。Foxp3特异性地表达在CD4+、CD25+Treg 细胞上，并在该细胞的发育和功能维持中起很重要的作用，进而提示Foxp3可能是CD4+、CD25+Treg 细胞的一个特征性标志[2]。近几年的研究发现调节性T细胞有可能以某种机制抑制着机体对肿瘤的免疫应答，从而导致肿瘤的发生[3]，目前调节性T细胞与肿瘤免疫机制及治疗的研究逐渐成为热点。 甲状腺癌是最为常见的内分泌恶性肿瘤之一，占头颈部肿瘤的首位，本研究为探讨Foxp3+∕CD4 T细胞在甲状腺恶性肿瘤患者外周血手术前后外周血中的表达，我们建立三色法流式细胞术检测CD4+、CD25+调节性T细胞Foxp3的方法，并讨论其临床意义。 材料与方法低温高速离心机（HERAEUS D-37520 德国）4ml以 EDTA抗凝，混匀。加淋巴细胞分离液，2000转/离心分钟取中间白色的淋巴细胞层，2000转/离心5分钟，去上清。加2ml PBS混匀，2000转/分离心5分钟，去上清。00μl上述单细胞悬液对照管和实验管别加入100μl管中加入CD4-Pcy5、CD25-FITC各5μl避光孵育分钟。buffer，混匀。2000转2000转2000转 μl Permeabilization Buffer，充分混匀，再加正常大鼠血清2μl，4℃避光孵育15分钟。无需Permeabilization Buffer清洗细胞，直接在对照管中加入IgG1-PE 2.5μl，实验管中加入Foxp3-PE 20μl。4℃避光孵育至少30分钟。对照管和实验管中各加入2ml Permeabilization Buffer，2000转统计学分析：采用SPSS11.5软件统计，，P＜0.0为有显著性差异。P＜0.05）。 2.3 甲状腺恶性肿瘤组进行肿瘤切除术后，外周血中的Foxp3+∕CD4 T细胞的平均比例（7.4435±6.3587%），而体检健康者为（3.7629±1.9996%），二者相比有显著性差异（P＜0.05）。 2.4 甲状腺恶性肿瘤术后组外周血中的Foxp3+∕CD4 T细胞的平均比例（7.4435±6.3587%）低于术前组（9.1492±6.4704%），无显著性差异（P＞0.05） 3. 讨论: 肿瘤的发生是肿瘤细胞逃避免疫监测的结果，在肿瘤宿主体内许多可以被自体T细胞识别的肿瘤相关抗原目前已经被证明是自身的正常组分。通过外周耐受抑制自身反应性T细胞活性的机制，也同样影响着对肿瘤相关的自身抗原的应答，从而参与肿瘤在宿主体内发生和发展，而具有免疫调节潜力的CD4+ CD25+ 调节性T细胞就是限制自身免疫反应的重要因素之一[3、4]。甲状腺肿瘤是较常见的内分泌腺肿瘤，临床最初多表现为无痛性甲状腺结节，在总人群中的发病率为4%～7%，其中大多数为良性，但约有5%为恶性[5]。 甲状腺癌发生、发展及预后是多种基因相互或独立作用的结果，了解各种类型甲状腺癌及其不同病程阶段的基因和编码蛋白表达变化，对于分析病变相关分子生物学具有重要的意义[6]。 本研究收集甲状腺恶性肿瘤患组24例，甲状腺切除术后组17例，体检健康组21例，用三色法流式细胞术检测外周血中CD4+∕CD25+ T细胞、Foxp3+∕CD4 T细胞的平均比例。结果表明，甲状腺恶性肿瘤术前组、术后组和体检健康组三组间CD4+∕CD25+ T细胞的平均比例经统计学处理无显著性差异。而甲状腺恶性肿瘤组无论术前、术后Foxp3+∕CD4 T细胞的平均比例均高于体检健康者（P＜0.05）。目前国内外有报道肿瘤患者外周血和肿瘤组织中CD4+∕CD25+ 调节性T细胞升高，并且在肿瘤组织切除后外周血中CD4+∕CD25+ 调节性T细胞的水平有所下降。本实验中甲状腺恶性肿瘤术后组外周血中的Foxp3+∕CD4 T细胞的平均比例（7.4435±6.3587%）低于术前组（9.1492±6.4704%），呈下降趋势，与国内外相关报道一致。为临床提供了观察患者手术