质粒DNA的提取02458.pptVIP

碱变性法小量提取质粒DNA 质粒的概念 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子；大小1～200kb,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。 具有自主复制和转录能力。能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。 存在于许多细菌、放线菌及真菌等生物中。 质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。 把一个目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中最常用的载体。 质粒DNA及质粒载体 DNA克隆的策略 质粒的用途 ——重组克隆的载体 提取质粒DNA的方法 　从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 碱变性法 煮沸法 SDS法 羟基磷灰石层析法 　各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。 碱变性法基本原理 SDS破细胞壁释放DNA后，在强碱条件下，质粒 DNA变性成单链。 当加KAc适当中和pH时，质粒DNA复性；而染色体DNA和大分子RNA仍为单链，并与蛋白质-SDS复合物被高盐沉淀，质粒DNA留在溶液中。 经酚:氯仿抽提，再用乙醇沉淀上层有机相中的质粒DNA。 试剂的生化作用： 1. Solution I 50 mmo