rBTI的内化及诱导HepG2细胞自噬的研究.docVIP

rBTI的内化及诱导Hep G2细胞自噬的研究 【摘要】：蛋白酶抑制剂广泛分布于自然界中,以不同形式存在于植物,动物及微生物体内,是一类可以作用于蛋白酶,并对酶有特异性抑制作用的小分子物质或蛋白质。它们按一定比例与酶结合形成可逆的蛋白质复合物,在血液凝固,补体级联反应,细胞凋亡的调控以及激素加工处理等过程中发挥重要的作用。荞麦胰蛋白酶抑制剂(BuckwheatTrypsinInhibitor,BTI)是由69个氨基酸组成的分子量为7.9kD的耐热小分子蛋白,属于PotatoI型蛋白酶抑制剂家族。本课题组的前期研究表明,重组的荞麦胰蛋白酶抑制剂(recombinantBuckwheatTrypsinInhibitor,rBTI),对HepG2,EC9706,K562,HL60等肿瘤细胞株都有明显的抑制生长并诱导其凋亡的作用,而对正常肝细胞HL7702没有影响；rBTI可以诱导促凋亡基因表达上调,抗凋亡基因表达下降,可以使EC9706细胞周期阻滞于Go/G1期,但是具体的分子机制还不清楚。本研究选用pExSecI表达载体,构建了含有BTI基因的表达质粒pExSecI-BTI,经原核表达和纯化,获得了无融合标签的rBTI,分析了rBTI内化进入HepG2细胞的机制,探讨了其诱导HepG2细胞自噬的分子机制,以及与细胞表面的可能受体uPA的相互作用。主要结果如下：1.构建了原核表达载体pE