胎儿肝干细胞与新型可吸收三维复合载体细胞相容性研究论文.pdfVIP

表3III组与Ⅳ组不同时间点淋巴细胞数(X 105)(文±s，n=6) 注：和III组比较：水P0．05 参考文献(略) 胎儿肝干细胞与新型可吸收三维复合载体细胞相容性研究 天津市第三中心医院天津市人工细胞重点实验室(300170) 于美丽杜智朱争艳高英堂高强 摘要研究聚酸酐一氨基葡聚糖三维载体材料对胎儿肝干细胞粘附及增殖的影响，寻找胎儿肝干 细胞新的载体材料。采用改进的两步胶原酶灌注消化法力1]percoll液不连续密度梯度离心的方法，分离 胎儿肝干细胞。选取胎儿肝干细胞的传代细胞，种植于聚酸酐一氨基葡聚糖三维载体材料上。倒置显 微镜下观察细胞的粘附和生长状况；计算细胞贴壁率；MTT法检测各组细胞的吸光度值(OD值)； 收集载体支架上细胞并计数。取细胞载体进行组织学切片，HE染色光镜下观察。在细胞培养第7天进 行免疫荧光化学染色和流式细胞仪检测。聚酸酐一氨基葡聚糖三维载体能促进肝干细胞在材料内粘附 并保持其在机体内的形态。载体材料内的肝干细胞功能活跃。在材料表面和三维空间内部培养的肝干 细胞均能持续增殖。经过连续40天共同培养聚酸酐一氨基葡聚糖三维载体对干细胞无毒性，人胎儿肝 干细胞可以很好的贴附于聚酸酐一氨基葡聚糖三维载体支架上，细胞增殖活力良好，标志物持续表 达，培养7天得到的细胞数量增多19．7％。聚酸酐一氨基葡聚糖三维载体能促进肝干细胞的增殖，可作 为肝干细胞的载体应用于肝脏组织工程。 引言 肝脏组织工程是将适当的种子细胞与载体支架材料相结合，经过培养，移植到患者体内代偿或 替代肝功能。肝干细胞具有分化成肝细胞和胆管细胞的能力，作为种子细胞移植有望成为治疗急性失 代偿性肝脏疾病和先天性肝脏代谢缺陷性疾病的有效手段。目前肝脏组织工程使用的高分子材料按来 源可分为天然高分子材料和人工合成高分子材料两大类：天然的高分子材料应用较多的有壳聚糖、胶 原，这类材料一般都亲水、无毒，生物相容性以及细胞亲和性好，缺点是材料强度和加工性能差，降 解速度偏快。人工合成高分子材料研究较多的有聚乳酸、聚羟基乙酸、聚氨酯等，这类材料具有力学 性能好、可加工性能较好以及降解周期可调节范围大等优点，但人工合成高分子材料的细胞亲和性及 细胞相容性逊于天然高分子材料。为结合两种材料的优势，本实验研究聚酸酐一氨基葡聚糖三维多孔 隙载体，其特点是聚酸酐和氨基葡聚糖都是具有良好生物相容性和生物降解性的高分子材料，对人体 无毒无害。聚酸酐不但可以支持细胞在生物体外的增殖，引导组织在生物体内的增长，传递生物活性 分子，而且由于聚酸酐的组成和结构，可以根据特殊的需要进行调整，因而具有设计上的灵活性。氨 基葡聚糖可促进细胞分泌II型胶原和蛋白多糖，具有亲水性，促进细胞黏附。通过对聚酸酐一氨基葡 聚糖三维载体对胎儿肝干细胞粘附及增殖的影响研究，探讨该三维载体作为胎儿肝干细胞载体材料的 可能性。 ·325· 材料与方法 2．1实验仪器及耗材 Sigma3．18K离心机；KDC．2046{氐速冷冻离心机；ThermoC02培养箱；倒置相差显微镜 Steri—Cycle (CKX．31，Olympus，Japan)：流式细胞仪(FACs，BECKMAN 2。2聚酸酐一氨基葡聚糖三维载体制备与灭菌处理 50：50，IR光谱在2931．5lcm-1、2850．77cm．1附近的吸收峰为脂肪长链烷基特征吸收峰；在约1059．65 cm．1的吸收峰为酸酐特征吸收峰。在3000cm．1以上无吸收峰，证实聚合物中不存在羧基和羟基官能 团。GCP相对分子质量测定：P(DA—SA)聚酸酐的重均相对分子质量Mw≥20000。 直径分别为3．9cm、1．8cm、37mm的载体。2．09氨基葡聚糖(sigma．USA)，和20mg透明质酸钠(山东 ml 正大福瑞达药业公司)，加入30rnl双蒸水中搅拌至完全溶解解，加入101％EDAC(乙基二甲基胺