第二节聚合酶链反应PolymeraseChainReaction.pptVIP

聚合酶链反应 掌握PCR技术的原理和方法 了解其应用 掌握琼脂糖凝胶电泳技术 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种技术。 这种技术操作简单、实用性强、灵敏度高、可以自动化， 因而在分子生物学、基因工程研究，以及遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。 （1）变性　加热模板DNA，使其解离成单链； （2）退火　降低温度，使人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下与模板DNA所需扩增序列结合； （3）延伸　在适宜温度下，Taq DNA聚合酶利用dNTP使引物端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。 每一个循环产物可作为下一个循环的模板，因此通过35个循环后，目标DNA片段可能性扩增可达235倍。 器 材 PCR扩增仪、 掌式离心机、 0.5ml PCR 管 枪头 移液器 1．将PCR反应组分放在冰上解冻，并进行短时间的离心以使组分沉降管底。 2．根据下列顺序在PCR反应管中加入各反应组分： 10＊Reaction Buffer(MgCl2-Free) 5ul MgCl2(25mM) 3ul 4＊dNTP Mixture (each 2.5mM) 4ul Primer L-110(12.5pmol/ul) 2ul Primer R-110(12.5pmol/ul) 2ul Human Genomic DNA(0.5ug/ul) 1ul Taq DNA Polymerase(3u/ul) 1ul Nuclear-Free Water 32ul 3．将反应组分混匀后，加入50 ul石蜡油，然后离心数秒。 4．根据下列参数进行PCR扩增： 预变性 94℃ 5min 变性 94℃ 60s 退火 50℃ 45s 25-30循环 延伸 72℃ 45s 最后延伸 72℃ 5min 5、PCR产物的检测: 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的常用方法，具有简便、快速的优点。 DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构象有关。 对于线性DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。 在凝胶中加入少量溴化乙锭，其分子可插入DNA的碱基之间，因此可在紫外灯下直接观察到DNA片段在凝胶上的位置，并可在紫外灯下或经凝胶成像系统观察或拍照。 ①称0.2g琼脂糖，加20ml电泳缓冲液 （1×TAE）加热熔化。 ②胶液冷至60℃时，加EB 3μl，小心混匀，缓慢倒入制胶模具中，在胶一端插上梳子。 ③待胶凝固后，拨出梳子，将模具置于电泳槽中，加入1×TAE，让液面高于胶面1mm。 ④在做完PCR的样品中加入上样缓冲液，上 样。 ⑤接通电源，保持恒定电压，开始电泳。 ⑥根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳。切断电源后，取出凝胶，紫外灯下或经凝胶成像系统观察或拍照 二、几种重要的PCR衍生技术 （一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 * * * * * * 目 录 * 目 录 实验题目 实 验 目 的 实 验 原 理 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 一、PCR基本工作原理 目 录 Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 目 录 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ 二、PCR体系基本组成成分 三、PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C PCR每一个循环由三个步骤组成： 试剂盒: 采用华美生物工程公司生产的DNA PCR系统-110 实 验 操作 实 验 结 果 根据紫外灯下观察的结果，画图 500bp 1000bp PCR 的实际应用价值 实 验 讨论 （一）目的基因的克