地衣芽孢杆菌普鲁兰酶编码基因的克隆与表达.pdf

摘要 摘要 普鲁兰酶(EC．3．2．1．41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支中的Q．1，6．糖菅键，从 而剪下整个侧支，形成支链淀粉的解支酶。它在淀粉加工工业中有着非常重要的用 途，可以大规模的提高淀粉的利用率和生产效率。普鲁兰酶可以单独使用，亦可以与 其它酶配合使用，当前较成熟地应用于高葡糖浆，高麦芽糖浆和干啤酒生产中。普鲁 兰酶的水解性质决定了它具有提高淀粉质原料利用率、降低粮耗的作用，因此它在淀 粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。地衣芽孢杆菌的全基因组序列已在 2004年被公布，对基因组序列分析显示，其中有一段大小为2133 bp的片段可能编码 普鲁兰酶基因，并被标注为amyX．多年来，地衣芽孢杆菌作为外源基因表达宿主被用于 包括普鲁兰酶在内的多种外源蛋白的表达，但有关地衣芽孢杆菌自身产生的普鲁兰酶 及其基因则国内外均未见实验研究报道。 的表达。在实验室发酵时，检测到的酶活大约为5．6U／mL。重组工程菌连续转接5代 后，经接种培养、诱导发酵及PCR反应鉴定表明具有良好的遗传稳定性。 重组菌所产的普鲁兰酶分子量约为80kD左右；重组酶的最适作用温度范围为35 ℃--45℃，在pH 都具有较高的活性；该酶具有很好的热稳定性，40℃保温64h仍有40％的残余酶活。 度的促进作用；而添加C、Na十、Li+、Ni2+和Ba2+对该酶无明显的激活或抑制作用； 5×10。mol／L的SDS使酶完全失活，这可能是由于该普鲁兰酶分子中缺乏二硫桥结构的 缘故。 对重组菌的发酵条件进行了初步优化，采取了单因素试验分别考察了不同的氮 源、诱导时机、培养温度、初始pH、装液量、接种量对产酶的影响。得到了产酶的最 佳培养基：酵母膏l％，蛋白胨1％，NaCI 0．012％，MnS047H：OO．012％；产酶的最佳培养条件：培养3h后诱导，培养温度为20 mL摇瓶加入培养基20mL，接种量10％。 ℃，培养基的pH值为6．0，装液量为250 通过优化后酶活提高到6．5U／mL左右。 以上结果表明，本研究构建的基因工程菌能够表达普鲁兰酶，实验室摇瓶发酵 时，酶活约为5．6U／mL；其粗酶的酶学性质得到了初步研究；通过对发酵条件进行优 化，最佳发酵条件的普鲁兰酶产量平均可达到(6．5士O．1)U／mL。因此，该株工程菌所 产的普兰酶为普鲁兰酶酶制剂的工业化生产及应用奠定了一定的基础。 关键词：普鲁兰酶，地衣芽孢杆菌，amyX,酶学性质，发酵条件优化 Abstract Abstract 3．2．1．4 considereda 1)is Pullulanase(pullulanase-6-glucanohydrolase，ECusually that cleaves in enzyme a一1，6glycosidiclinkagespullulan，starch， debranching specifically in related is used enzymewidely amylopectin，andoligosaccharides．The itCan the and ofstarchona industry,because utilityefficiencyproductivity