基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱高通量血清代谢组学方法.pdfVIP

Vo1．34 高 等 学校 化 学 学报 NO．1 2013年 1月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES 77～83 doi：10．7503／ejc 基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨 质谱的高通量血清代谢组学方法 成 玉 ，刘玉敏 ，黄凤杰 ，陈天璐 ，郑晓皎 ，赵爱华 ，何品刚 ，贾 伟4 (1．华东师范大学化学系，上海 200062；2．上海交通大学药学院，上海 200240； 3．上海交通大学附属第六人民医院，上海200233； 4．DepartmentofNutrition．UniversityofNorthCarolinaatGreensboro，Kannapolis28081，USA) 摘要 采用超高效液相色谱。四极杆飞行时间高分辨质谱 (UPLC—QTOFMS)联用技术，对血清前处理进行了 考察和优化，并对液．质联用分析条件进行了优化，旨在建立用于血清中广谱小分子代谢物分析的高通量强 耐用代谢组学方法，以期满足大批次生物样本数代谢组学研究的要求(样本数／400个)．通过考察不同有机 溶剂沉淀蛋白对血清中蛋白的去除程度及38个代表性标准品化合物的提取效果，确定采用 甲醇／乙腈 (体积 比1：9)沉淀蛋白法．血清和有机溶剂的体积 比不小于1：4ft~，达到最佳的沉淀蛋白处理效果，符合大批量 样本测试的要求；预先冷藏沉淀蛋白的有机溶剂 ，涡旋2min，超声1min，加入有机溶剂后冷冻静置10min， 可以进一步提高前处理沉淀蛋白和化合物提取的效果．通过对不同流动相体系和梯度条件的考察，对液-质 联用分析条件进行了优化．方法学考察结果表明，本方法重现性、精密度及稳定性均 良好．对重现性和48h 稳定性数据进行变异系数分析和主成分分析法的多维分析 ，证明本方法在代谢组学研究中的可重复性及所 得数据的可靠性．本方法高通量强耐用，每天可测定 100多个血清样本(13min测定1个样本)，适用于代谢 组学研究，特别是大批次生物样本的代谢组学研究． 关键词 代谢组学；血清前处理方法；超高效液相色谱一四极杆飞行时间高分辨质谱(UPLC—QTOFMS)；超 声；主成分分析 中图分类号 0657 文献标志码 A 近十年来，代谢组学作为系统生物学的重要组成部分，继基因组学、转录组学和蛋白组学之后得 到了迅速发展，并在制药、药物毒理、临床疾病及营养学等领域得到了应用 ¨叫．代谢组学是研究生 物体内源性代谢物变化规律的科学 ~8_．人体血液作为代谢组学研究领域中的重要体液样本，主要分 为血浆和血清．与血浆相比，血清不含纤维蛋白原，成分较为简单，约含有 1000多种内源性小分子代 谢物 ]，是重要的代谢组学体液样本．与血浆相似 ，血清的前处理过程相对复杂 ,12j．由于含有大 量的蛋 白质类成分，进行超高效液相色谱一四极杆飞行时间高分辨质谱 (UPLC—QTOFMS)联用技术分析 前需要沉淀去除蛋 白质 l ．由于血清中所含小分子代谢物种类多、极性跨度大，既有高极性的氨 基酸、葡萄糖和核苷类等，也有低极性的脂类和固醇类等，代谢物成分的复杂性增加了血清样品分析 的难度 ]．另外，血清中代谢物成分的含量不同，动态范围大，也给分析带来了困难．目前前沿的分析 技术是UPLC—QTOFMS联用技术 J．由于UPLC体系使用 1．7Ixm超细粒径填料填充的色谱柱，比常规 液相色谱 (HPLC)体系的分析速度至少提高l倍，分析分离效率提高数倍 ，但由于UPLC色谱柱使用超 细粒径填料，且柱直径较细 (2．1mm)，柱长度较短 (100mm)，柱容量比HPLC色谱柱 (柱直径4．6 mm，柱长度 150mm)减小7倍多，因而UPLC色谱柱的耐污染性较差，很容易被堵塞污染，难以分析 大批次血清或血浆样本．本文旨在建立高通量强耐用的血清代谢组学分析方法，以期用于大批次生物 样本的代谢组学研究．对血清前处理和液．质联用分析条件进行了优化及方法学考察．对重现眭和48h 收稿 日期：2012~3—1