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猪繁殖与呼吸综合征、猪2型圆环病毒病二联基因疫苗的构建.pdf
中国动物检疫 2010年第 27卷第 3期 —.42—.
2 3 4 plRES—ORF2一ORF5一ORF3中的 目的基 的病料,其中PCV2与PRRSV皆为阳
因 ORF2、ORF5、ORF3/ORF5在 HeLa细 性的比例高达 47.4%。所以,二联疫苗
胞中得到表达。 的研制具有重要意义。
1700bp 3 讨论 pIRES为 CLONTECH公司研制开
835bp 目前用于预防PRRS的主要是弱 发的新一代真核表达载体质粒,已通
毒苗和灭活苗,但弱毒苗存在毒力返 过美国FDA认证,其采用氨苄青霉素
2 3
1:DNAmarker(DL2000);2:DNAma~er
( -EcoT14 );3:对照质粒 pIRES—
ORF2一ORF5-ORF3;4:B 1I(positive)
图2 质粒pIRES-ORF2-ORF5一ORF3M切鉴定结果
组质粒 的细胞浆中有明显的黄绿色
荧光,而转染 pIRES质粒的细胞则无
特异性荧光出现 ,荧光抗体染色结果
呈红色 (图3)。
A:1:pmtemmarker;2:plRES(PCV2~L体);3:pIR.ES—ORF2一ORF5一ORF3(PCV2;]~体)
B:1:proteinmarker;2:pIKES—ORF2-ORF5一ORF3(PRRSV~t,体 );3:pIRES
(PRRSV抗体)
图5 重组表达质粒PIRES-0RF2_oRF5_0RF3的WesternbIot检测
强的危险,且有可能传播疫苗毒,灭 抗性。它携带细菌复制起点,可以在
活苗的效果不十分稳定,而且经常导 工程菌 (如 DH5Q和ffM109)中复制和
致免疫失败。为此各国学者都在努力 扩增。同时具有来源于人巨细胞病毒
E F
A:pIRES-ORF2-ORF5(PCV2抗体 );B: 寻找安全、效果可靠 、有效 的基因工 CMV的复合启动子 PCMV和来源脑心
pIRES-ORF2-ORF5(pRRSV抗体 );C: 程苗。Duran等用杆状病毒表达系统 肌炎病毒的单一启动子 IRES,可以在
plRES-ORF2-ORF5一ORF3(PCV2抗体 ): 进行 了PRRS重组亚单位疫苗 的研 转染的哺乳动物细胞中表达外源基
D:plILES-ORF2-ORF5—0RF3(PRRSV抗 究,他们将 ORF2—7分别插入到重组 因。pIRES的最大的优点是在同一个
体 );E:pIPES(PRRSV~体 );F:pIPE S 杆状病毒的多角体启动子下游,应用 表达载体上含有两个启动子,可以将
(pRRSV抗体 ) sf9细胞进行表达,利用表达产物分 两个外源基因分别插入两个不同的
图3 核酸疫苗质粒转染HeLa细胞的荧光 别免疫妊娠母猪,通过检测断奶仔猪 启动子下游 ,同时进行表达,为两种
照片 (伊文斯蓝染色) 的健康状况 以及成活率等指标来证 疾病的联合免疫提供了方便。
2.3 Westernblotting检测 明,ORF3和 ORF5表达产物能提供一 本实验中,分别将 PCV2的ORF2
Westernblotting结果表明:转 定的免疫保护,并能阻止病毒复制。 基因插入真核表达载体 plRES单一
染质粒 pIR
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