HRE／CMV启动子的克隆和缺氧调控活性的测定.pdfVIP

维普资讯 · 2432· 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2007，23(12)：2432—2435 [文章编号] 1000—4718(2007J12—2432—04 HRE／CMV启动子的克隆和缺氧调控活性的测定水 杨 洁。， 杜德伟。， 李 占亭。， 贾林涛 ， 赵 晶 ， 许彦鸣 ， 杨安钢 ， 孙脊峰 (第四军医大学唐都医院肾脏内科，陕西 西安 710038；第四军医大学 基础部 免疫学教研室，生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安710032) [摘 要] 目的：将具有缺氧调控作用的多种缺氧反应元件 (HRE)与CMV启动子组合，以获得缺氧应答启 动子。将荧光素酶报告基因置于缺氧应答启动子的下游 ，通过检测荧光素酶活性的方法 ，方便地研究缺氧应答启 动子缺氧诱导的作用。方法：合成多种 HRE核苷酸序列，并设立 HRE突变对照，克隆人 pCI—neo中，构建、HRE／ CMV启动子。扩增 HRE／CMV序列，定向亚克隆人 pGL3一Basic中，获得 HRE／CMV荧光素酶报告载体。瞬时转 染HeLa细胞 ，在0．1％O：环境下培养细胞 ，并设立正常氧分压环境对照。检测荧光素酶的相对活性。结果：成功 构建了HRE／CMV荧光素酶报告载体，其 中mPGK—HRE／CMV载体表现出很好的缺氧诱导作用和高水平的表达。 结论：mPGK—HRE／CMV启动子能够有效地进行缺氧诱导和调控工作。 [关键词] 缺氧反应元件；荧光素酶；基因，报告 [中图分类号] R692 [文献标识码] A CloningofHRE／CMV promotersanddeterminationofhypoxiaregulato- ry activities YANGJie，DU De—wei，LIZhan—ting ，JIA Lin—tao ，ZHA0Jing ，XU Yan— ming，YANGAn—gang ，SUN Ji—feng (DepartmentofNephrology，TangduHospital，FouahMilitaryMedicalUniversity，Xian710038，China；Departmentof Immunology，DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology，FouahMilitaryMedcialUniversity，Xian710032，Chi- M．E—mail：Jifeng—sun@medmail．com．cn) [ABSTRACT] AIM：ToobtainvarioushypoxiaresponsepromotersbycombiningCMVpromoterwithdiversehy- poxiaresponseelement(HRE)andtoidenti~thepotencyofhypoxiaresponsepromoterswhichwereputupstreamoffirefly luciferasereportergeneandswitchedfireflyluciferasereportergeneonandoffbasedupo nsensingtissuehypoxiabymeans ofdetectingrelativeluciferaseactivity．METHODS：DiverseHREgenesandmutationcontrolweresynthesizedandcloned intopCI—neovectors toconstructHRE／CMV promoters．AmplifiedHRE／CMV promotergeneswerethensubelonedinto pGL3一Basicvectors toobtainHRE／CMV luciferasereportervectors．Thevectors were transientlytransfectedin