用高效液相色谱法对真核细胞脱氧核糖核酸中碱基含量的研究.pdfVIP

用高效液相色谱 法对真核细胞 脱氧核糖核酸 中碱基含量的研 究* 都恒华 吕慧梅 郑庆泉* 焦中华* 南（京大学化学系） 南（京大学生物系） [提要] 本文提出了一个快速定量测定脱氧核糖核酸DNA）水解产物中各碱基含量的高 效液相色谱法。在HypersilODS柱上，用06M醋酸钠，4 甲醇PH7作洗脱液，可将胞 嘧 啶 C 、尿嘧啶 U 、鸟嘌呤 G 胸腺嘧啶T 腺嘌呤A五种碱基基线分离。方法简 便，12分钟可完成分离，取样量0.3 克或更少，最低检出极限约5毫微克3（0pmole，标准 偏差在0.1 0.8。对中、幼年小白鼠全脑，小牛胸腺，鱼精DNA中的碱基进行了测定，结果 与文献值基本一致。 DNA的碱基组成具有种的特异性，即 啶,胸腺嘧啶 T，尿嘧啶 均（为上海试剂 不同生物种的DNA具有自已独特的碱基组 二厂产品）；鸟嘌呤、鱼精 DNA 上（海东 成。因此测定DNA的碱基组成不仅可以用 海制药厂），以上均为98 ；小牛胸腺DNA 作生物分类的指标、阐明生物之间亲缘关系， 上（海牛奶公司）。其它试剂均为分析纯。 而且对研究DNA的结构也具有重要意义。 甲醇重蒸馏一次。水为亚沸蒸馏器重蒸馏 DNA中各种碱基的测定方法有薄层层 水。流动相和样品溶液均经0.5μ蘭m滤膜过滤。 析法[1]，纸层析法[2]，热变性温度法[3，浮 等摩尔A，G，C，T，U混合溶液的配制： 力密度法[4]等。随着高效液相色谱 HPLC） 用0.1毫克／毫升的碱基储备溶液配成各碱基 的发展，Horvath等[5]用薄壳型离子交换树 浓度约为1.7×10-4M的溶液 用（氢氧化钠调 脂分离了鸟嘌呤 G 腺嘌呤A 胞嘧啶 节pH为4）当天配制。各种DNA水解方法按 C）和尿嘧啶U）四种碱基。KO等[s]用阳离 文献[11]。取 1毫克试样，最后稀释为2.5毫 子交换树脂测定了微生物DNA中G（+C）的 升。 摩尔百分含量。Ehrlich等[7]和 Hoffman 二（）小白鼠全脑 DNA 的提取与纯化 等[8]用反相离子对色谱法分离碱基。潘星时 昆明种小白鼠由本校动物房提供，幼年 等[9]用HPLC梯度洗脱法对细菌DNA中的 小白鼠 （ 30天）和中年小白鼠 （，一 G+C）含量进行了测定。本文用HPLC法 年），每批各50只。取其全脑，按文献[10] 分离和测定了小白鼠全脑、小牛胸腺和鱼精 报道的方法提取，纯化DNA。产品的紫外 DNA中的碱基，方法灵敏，快速，重现性好。 吸收A260/A280在1.80～?1.90，表示不含蛋白 及DNA。DNA的 λ极大在260nm， 极小在 实 验 部 分 230nm左右，符合其特征吸收。用琼脂糖凝 一（）仪器与试剂 胶电泳检查其纯度，仅DNA一个斑点。 高效液相色谱仪，日本岛津 LC-4A， （三）分析方法 SPD-1分光光度检测器，C-R2A数据微处 理机，R-112M记录仪。 *中国科学院科学基金资助的课题。本校生物系毕业 生郭联庆参加部分工作。 腺嘌呤 上（海生化研究所）；胞嘧 *为化学系毕业生。 标准碱基溶液 各（碱基含量约为100ng/ 5μ）的色谱图如图1所示。用校正面积归 一化法测定各碱基的相对摩尔百分含量。先 以等摩尔标准碱基注入柱内，得色谱图，根 据各碱基量与峰面积的比率计算得各碱基的 校正因子。然后注入样品溶液，从分离所得 碱基的峰面积乘以校正因子即得各碱基的含 量。根据C，G，T，A的总量，计算其中 G（+ C）的摩尔百分含量。 时间较长。加甲醇至4％时，各组分的保留