1-Real-time PCR原理与应用.pdf

荧光定量荧光定量PCRPCR技术的技术的原理与应用原理与应用 张晓辉张晓辉 PCR产品经理 北京元业伯乐科技发展有限公司 提纲 • 荧光定量PCR技术原理 • 荧光荧光化学物质简介学物质简介 • 定量定量PCRPCR技术延伸技术延伸 • 基因分型（SNP）检测 • 熔解曲线分析 • 荧光定量荧光定量PCRPCR技术应用技术应用 常规PCR 常规常规PCRPCR技术技术 ：： PCR后借助电泳对扩增反应的终产物进行定量及 定性定性分析分析 S1 S2 M 常规PCR 常规常规PCRPCRPCRPCR 结合结合结合结合 电泳分析方法的缺点电泳分析方法的缺点 • 只能对终产物进行分析，无法对起始模板准确定量 • 必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，费时费事 • 无法对扩增反应实时检测 • EBEB有毒有毒 定量PCR 定量定量PCR技术技术 ： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一 个循环扩增产物量的变化个循环扩增产物量的变化，通过通过CtCt值和标准曲线实值和标准曲线实 现对起始模板 的定量分析 IQ5 Real-time PCR仪 PCR反应混合物反应混合物 荧光物质 2+ Mg Taq DNA多聚酶 或 2+ Mn 模板DNA dCTP dGTPdGTP dUTP 引物 dATP 缓冲液 荧光曲线荧光曲线 随着随着PCR反应的进行反应的进行 ，，扩增产物不断累积扩增产物不断累积 ，，荧光信号荧光信号 强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度 信号，得到一条荧光扩增曲线图 定量原原理 ● 如何对起始模板定量如何对起始模板定量？？ ● 通过Ct值和标准曲线实现对起始模板 的定量分析 ● 引入两个概念引入两个概念：： ● 荧光阈值、Ct值 定量原理定量原理 荧光阈值荧光阈值 在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度 标准(即PCR扩增产物量的标准) 阈值线 定量原原理 CtCt值的概念值的概念 Ct值的定义是PCR扩增过程 中中，，扩增产物((荧光 信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数 C(t) 值 C(t) 值 18.12 +/- 0.0