脯氨酸和羟脯氨酸层析斑点的显色定量测定法.pdfVIP

脯氨酸和羟脯氨酸层析斑点的显色定量测定法 吴有光 南国华 江（西医学院，南昌） 脯氨酸及羟脯氨酸层析斑点的显色定量至今无 理想的方法，通常是用茚三酮(1)或吲胚哚狨醌2溶液 显色，前者呈黄色，敏度低，很少用于定量分析， 而后者虽显特异蓝色。但极不稳定，也难以作定量 分析。Jepson等3〔〕曾对羟脯氨酸先用茚三酮或吲 哚狨醌溶液显色，再用Ehrlich试剂显色，呈特异紫 色，但未见定量分析报导，Hrabetova等4 曾用吲 醌醋酸锌异丙醇液显色测定脯氨酸；Heathcote 等 5〕用镉－茚三酮液显色测定各氨基酸层析斑 点，此二种氨基酸斑点呈黄色，须在350毫微米波 长比色定量，且稳定性欠佳。 本文报导的显色测定法，是在第一次用镉－茚 中），方式见图1。随着溶液渐渐上渗，斑点呈深紫 三酮对各氨基酸层析斑点显色后，再用吲胚哚狨醌液对 红色，待整个斑叩点都渗上溶液后，立即取出，剪入 比二种氨基酸斑点进行第二次显色。此法的稳定性 酸化甲醇中洗脱30分钟。在510毫微米波长下比色 和重复性良好，定量测定的敏感度为 10--10-7 定量。空白对照液为在作了二次显色后的滤纸上取 克。可用于纸层析、纸电泳、和某些薄层层析的二 与此二种氨基酸斑点面积相仿的空白点，分别作与 种氨基酸斑点含量测定。 此二种氨基酸显色斑点同样的褪色和洗脱处理。 此二种氨基酸指纹法分离测定的标准 曲线制 一、材料与方法 作，和用指纹法分离测定明胶水解物中此二种氨基 脯氨酸为层析纯，羟脯氨酸为BDH试剂，其 酸含量所进行的回收实验皆与文献 10〕中报导的方 他主要试剂均为分析纯试剂。 法同。只是层析溶剂改为正丁醇：冰乙酸：水，层 0.5％镉－茚三酮显色液、0.5％吲胚哚醌显色液 析展开二次。 和1％硅酸钠的硅酸钠溶液分别参照文献 〔,7,8 二、实验结 果 文献中方法配制。 明胶水解物的制备按Meloum(9)法进行。 一（）对这二次显色法与单纯用镉 茚三酮液 将纯脯氨酸及羟脯氨酸水溶液，用微量注射 显色所得的显色复合物的洗脱液进行了稳定性比较 器，在冷风吹拂下点在滤纸上，用镉-茚三酮溶液 实验。结果见图2。从图中可见二次显色法的氨基 均匀浸润之，空气中悬放两分钟。置于50°下显色 酸显色复合物较单纯用镉?-茚崛三酮溶液的稳定性好。 30分钟，取出，用淡铅将斑点圈上。而后再滴加 二（）表1所表示的实验结果说明：此二次显 或（浸润）0.5%吲胚 醌液，复将滤纸量于45- 色法与单用镉-茚三酮溶液显色的敏感度相仿，脯 50℃下进行第二次显色20分钟。取出，将脯氨酸斑 氨酸略低，而羟歉脯氨酸增高，比用茚三酮丙酮溶液 点剪下，浸入硅酸钠溶液中，即呈赫红紫色，迅速 显色的敏感度要高一个数量级以上。 取出再浸入10%冰醋酸的丙酮中中和，而后立即剪 三（）消光值与氨基酸含量之间直线关系实验 入事先盛有5%冰醋酸酸化甲醇的试管中，塞严， 进行了三次，结果表明此二种氨基酸在 1-16微克 置于阴冷避光处洗脱30分钟。而对羟脯氨酸则剪一 量范围内直线性良好。我们又采用指纹法制作了此 二端突出形状，镊住长而狭的一端，将短而宽的一 二种氨基酸的标准曲线 （图3 ，从图上可见在 端接触硅酸钠液面， 切（不可将斑点本身浸入溶液 2-16微克量范围内线性良好。