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大鼠Sirt1基因原核表达质粒的构建及融合蛋白表达
?417,
大鼠Sirtl基因原核表达质粒的构建及融合蛋白表达
耿义群傅玉才1徐小虎王伟1许锦阶1
【摘要】
(汕头大学医学院法医学教研室,广东汕头515041)
目的构建大鼠Sirtl基因重组原核表达质粒pET41?Sial,表达其重组蛋白,为进一步研究Sial在哺乳动物细胞内的作用奠定基
础。方法根据GenBank中大鼠Sirtl基因序列没计引物,用RT-PCR扩增得到含BamHl/XhoI酶切位点的Sirtl片段,克隆至pCE~t-Teasy载体后亚克隆至原核表达载体pET41,测序鉴定后,转化宿主菌进行表达、蛋白纯化,SDS.PAGE鉴定。结果从大鼠脑的mRNA中扩增出特异Sial基因片段长506bp,经酶切鉴定及DI、IA序列测定,证实pE'r41一Sirtl重组质粒构建正确,表达融合蛋白分子量约为48kD。结论成功构建重组原核表达质粒pET41.Sial,并能表达融合蛋白,其分子量大小与预期一致。
【关键词】大鼠;Sirtl;基因表达;重组蛋白【中图分类号】11394.3
【文献标识码】A
【文章编号】1005-9202(2007)05-0417-03
Constructionot"prokaryotieexpressionGENG
plasmldwithratSift1geneandfusionproteinexpression
Yi-Qlm,FUYu-Cai,XIJXiao—ltu,et以
DepartmentofForensicMedicine,MedicalCollegeofShantouUniversity,Shantou515041,Guangdong,Chi??a
【Abstractl
Afragmentof
rat
objeetive
Toconstructa
recombinantexpressionolasmidwith
were
ratSirtlcDNAandto/b-6ed6e533bb68a98271fefa61.htmlobtainthefusion
protein.Methods
easyvector
Wills
SialcDNAcontainingBamHlJ'Xh01
amplifiedby
were
RT—PCRThefra瘁nentw羽clonedintopGEM-T
andin.
subelonedintoPE’r4lvector.Subsequently,E.eoliduced
B也l
cells
lransformedbvtherecombinantvlasmidThefusionprotein.which
by∥rGw柏purifiedandWiltsanalyzedbySDS-PACE.ResultsAfragmentof506bpofmtSirtleDNAwas
PCRTheconstructionoftherecombinantplasmidPET41-Sial'wasconfirmedbysequencing.Thefusionproteinof48kD
i)urified.Conclusions
Therecombinantplasmidhasbeensuccessfullyconstructed.Thefusionproteinof
rat
amp肺ed
was
byRT—
expressedand
Sirtl
1311/1
beexpressedinE.coli
BL2lcellswiththeexpectedtoolecularweight_
【KeYwords】Rat:Sial;Geneexpression;Recombinantprotein
沉默信/b-6ed6e533bb68a98271fefa61.html息调节因子-2(Silentinformationregulator2,Sir2)基司)进行反转录合成eDNA第一链。根据GenBank中大鼠Sirtl的mRNA序列(XM-228146)设计引物(上海基康生物工程公司合成):上游引物序列:5'-ccATCCITcA’I’I-I.^TcAGAG’I’rGc—
因是最早在酿酒酵母(Saecharomyeeseerevisiae)中发现的长寿基因,在酵母、线虫、果蝇和小鼠中Sir2的表达随着生命的进程而逐渐降低,高表达能不同程度地延长寿命…。在哺乳动物细胞的研究已证实,其同源基
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