萌动激活赤灵芝孢子粉对肿瘤组织端粒酶活性抑制作用的研究62294.docVIP

《中草药》Chinese Traditional and Herbal Drugs 2001年第32卷增刊 ·135· 萌动激活赤灵芝孢子粉对肿瘤组织端粒酶活性抑制作用的研究 陈小君(，冯翠萍2，刘 昕2 (1. 中山医科大学 肿瘤防治中心肿瘤研究所，广东 广州 510060；2. 中山大学生命科学学院，广东 广州 510275) 中图分类号：R282.71 文献标识码：A 文章编号：0253 - 2670(2001)S0– 0135 - 02 灵芝孢子(The spores from Ganoderma lucidum Karst)是灵芝发育周期中的另一形态，即灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来的象淡雾状的极其微小的孢子，具有灵芝的全部遗传活性物质。近年来对灵芝的研究极为广泛[1~5]。有许多研究表明灵芝及灵芝孢子粉对各种肿瘤有明显的抑制作用[2~4，6~7]。但对其抑瘤作用的机制研究较少，本文首次研究了灵芝孢子粉对端粒酶活性的影响并探讨其对抑瘤作用 机制。 1 材料与方法 1.1 材料：试验用NIH小鼠，由广东省卫生厅实验动物中心提供。鼠重20~22 g，雌雄各半。小鼠肝癌(Hepatoma)由本所提供。萌动激活赤灵芝孢子粉口服液(0.2 g/mL)由中山大学国家教育部食品工程研究中心及广州绿色盈康生物工程有限公司提供。端粒酶PCR-ELISA试剂盒和蛋白Assay ESL试剂盒均由BOEHRINGER MANNHEIM 公司提供。 1.2 肿瘤组织的获取：无菌条件下抽取腹腔保种7 d生长良好的腹水型小鼠肝癌细胞用生理盐水以1：1稀释后，将肿瘤细胞悬液接种于小鼠的右腋皮下，每只小鼠均接种0.2 mL。接种后的小鼠均随机分成4组，每组10只。阴性对照组：注射用生理盐水每天20 mL/kg；灵芝孢子粉低、中、 高剂量组：每天2，4，8 g/kg。各组小鼠均于接种瘤株后24h开始ig给药，连续用药10 d。观察各组小鼠的活动状况、皮毛光泽度及粪便性状。于最后一次给药后次日处死小鼠，剥离肿瘤组织，称瘤重并计算抑瘤率。无菌条件下取约0.2 g肿瘤组织，(20℃保存用于检测端粒酶活性。 1.3 标本提取液的制备：取标本约0.2 g，放于1.5 mL尖底离心管中，用已消毒的眼科剪刀，反复剪碎组织呈糊状。加入裂解液150 (L，充分混匀。置4 ℃冰箱1~2 h。离心 (4℃，15 000 r/min) 25 min。吸取上清液，放入0.5 mL管中，(20 ℃保存待用。 标本提取物蛋白蛋浓度的测定：在1.5 mL的比色杯中加入100 (L的试剂A；将标本提取液各50 (L加入相应的比色杯中，混匀。室温孵育5 min~1 h。在第一个比色杯中加1000 (L试剂B，简单的混匀，30 s后立即测定其485 nm波长的吸光度(A)值。以裂解液做为空白对照。以所测得的A值在校准曲线上计算相应的蛋白浓度。以10 (g为拟定标准蛋白量，计算所需标本提取液的量。 标本提取液的PCR扩增：25 (L扩增液，加标本提取液5 (L(2 (g/(L) 后加无菌水至50 (L，覆盖石蜡油。PCR扩增 ( 25 ℃、30 min，94 ℃、5 min，1个循环；94 ℃、30 s，50 ℃、30 s，72 ℃、90 s，30个循环；72 ℃、10 min，4 ℃保存。) 杂交及ELISA：PCR产物5(L+变性液20(L→室温10min，加杂交液225(L混匀，每孔取100(L→包被板中→室温，避光2h，用洗涤液洗3~5次，拍干，加入酶工作液100(L，室温，避光30min，用洗涤液洗3~5次，拍干，TMB底物100(L，室温，避光30min，终止液100(L，30min内酶标仪比色。 结果判定：在450 nm波长调整空白并以450及690 nm波长测样本孔A值。标本：450 ( 690 = A波长＞0.2 = 阳性 2 结果 2.1 灵芝孢子粉对小鼠肝癌有明显的抑制作用，低、中、高剂量组的抑瘤率分别为52.2%、62.7%及73.2%。各实验组瘤重与对照组瘤重比较，经t检验结果有统计学意义(表1)。表1 灵芝孢子粉对小鼠移植性肿瘤小鼠肝癌的作用 组别 剂量 (g/kg·d) 动物数 始/末 体 重(g) 瘤重(g) ((x±s) 抑瘤率 (%) 始 末 变化 对照组 — 10/10 21.88±1.17 34.73±4.99 +12.9 2.34±0.60 — 灵芝孢子粉 2 10/10 22.07±1.03 30.54±3.38 +8.47 0.74±0.20 62.8* 灵芝孢子粉 4 10/10 21.87±1.