牛双芽巴贝斯虫rap-1基因克隆与序列分析.docVIP

牛双芽巴贝斯虫rap-1基因的克隆与序列分析 摘要：对牛双芽巴贝斯虫（ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ）潜在药物靶标rａｐ－１的基因进行克隆与序列分析。以兰州株牛双芽巴贝斯虫基因组为模板，经ｐｃｒ扩增获得了ｒａｐ－１基因，将该基因克隆到ｐｇｅｍ－ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ上，对重组质粒进行ｐｃｒ扩增，对目的基因进行酶切鉴定及序列测定分析。结果表明，ｒａｐ－１基因长度为８４６ ｂｐ，同源性分析结果显示，克隆序列与ｇｅｎｂａｎｋ收录的巴西株牛双芽巴贝斯虫的核苷酸序列同源性为９９．７４％，说明兰州株牛双芽巴贝斯虫的ｒａｐ－１与ｇｅｎｂａｎｋ公布的参考基因具有高度同源性，ｒａｐ－１基因具有很高的保守性。 关键词：牛双芽巴贝斯虫（ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ）；ｒａｐ－１基因；克隆；序列分析 ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒａｐ－１ ｇｅｎｅ ｉｎ ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ ｈａｎ ｌｉｎ１，２，ｚｈａｎｇ ｊｉ－ｙｕ２，ｙｕａｎ ｌｉ－ｇａｎｇ１，ｌｉ ｂｉｎｇ２ （１．ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｇａｎｓｕ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０， ｃｈｉｎａ； ２． ｌａｎｚｈｏｕ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， ｃｈｉｎｅｓｅ ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ｋｅｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｄｒｕｇ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ， ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ／ｋｅｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｎｅｗ ａｎｉｍａｌ ｄｒｕｇ ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ ｇａｎｓｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅ， ｌａｎｚｈｏｕ ７３００５０， ｃｈｉｎａ） ａｂｓｔｒａｃｔ： ｔｈｅ ｒａｐ－１ ｇｅｎｅ， ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｎａ ｏｆ ｌａｎｚｈｏｕ ｂａｂｅｓｉｏｓｉｓ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ， ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐｇｅｍ－ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ． ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｐｃｒ， ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｂ. ｂｉｇｅｍｉｎａ ｒａｐ－１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ８４６ ｂｐ． ｔｈｅ ａｌｌｏｇｅｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｌｏｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ｇｅｎｂａｎｋ ｗａｓ ａｓ ｈｉｇｈ ａｓ ９９．７４％， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｒａｐ－１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ． ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ； ｒａｐ－１； ｃｌｏｎｅ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙsis 牛双芽巴贝斯虫（ｂａｂｅｓｉａ ｂｉｇｅｍｉｎａ）在分类学上属梨形虫目巴贝斯虫科巴贝斯虫属，该类寄生虫寄生于牛的红细胞，引起牛的血液原虫病——牛双芽巴贝斯虫病［１］。牛双芽巴贝斯虫病又称红尿热，一年内可暴发数次，临床主要表现为红细胞数量明显减少、贫血、黄疸、可视黏膜出血和血红蛋白尿等，可引起宿主死亡［２］，该病是世界公认的危害养牛业的主要寄生虫病之一。牛双芽巴贝斯虫入侵红细胞的过程是感染发病的重要环节，对红细胞的入侵是由位于牛双芽巴贝斯虫细胞膜表面的顶体复合器以及棒状体上的相关蛋白质介导的［３］，位于棒状体的蛋白质家族被称为rａｐ－１（ｒｈｏｐｔｒｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）［４－６］，研究该类蛋白质的生物学特性及其功能对以rａｐ－１为靶标的药物筛选和牛双芽巴贝斯虫病的防治具有重要意义。目前国内基本没有针对rａｐ－１的相关研究和报道。 试验对兰州株牛双芽巴贝斯虫株的ｒａｐ－１基因进行ｐｃｒ扩增与序列测定，旨在分析比较该基因在不同虫株中的差异，为该基因的表达和生物学功能的进一步研究奠定基础。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 质粒与菌株 质粒ｐｇｅｍ－ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ和大肠杆菌感受态细胞ｊｍ１０９均购自ｐｒｏｍｅｇａ公司。 １．１．２ 主要试剂 血液ｄｎａ提取试剂盒、ｄｎａ凝胶回收试剂盒、ｅｃｏｒ ｉ限制性内切酶、ｄｌ２０００ ｍａｒｋｅｒ、ｄｌ５０００ ｍａｒｋｅｒ、ｉｐｔｇ等均为ｔａｋａｒ