中山大学基础医学院 周俊宜工具酶（周俊宜） (NXPowerLite).pptVIP

聚合反应的特点： 1、聚合反应具有方向性: 5’ ? 3’ ? 2、DNA 聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的 3- OH 逐个添加脱氧核苷酸，使核苷酸链不断延长。 5’ 5’ 引物 2）核酸外切酶活性 5’ A G C T T C A G G A T A 3’ | | | | | | | | | | | 3’ T C G A A G T C C T A G 5’ 5’ A G C T T C A G G A T A ? 3’ | | | | | | | | | | | 3’ T C G A A G T C C T A G C G A C 5’ ? 3’? ? 5’?外切酶活性 5’? ? 3’?外切酶活性 能切除突变的 DNA片段 能辨认错配的碱基对，并将其水解 A C 2 应用 1)切口移位法标记DNA 在DNase的作用基础上产生链内切口，应用此酶的5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切核酸酶活性的同步联合反应，使切口沿DNA链从5’-端向3’-端移动。若用于聚合反应的原料dNTP带有放射性核素α32P，就能使生成的双链带有标记物。 5’ 3’ * 中山大学基础医学院 周俊宜 fzyxzjy@126.com 基因组DNA 目的基因 目的基因 基因载体 重组体(复制子) 基因重组 核 酸 核酸水解酶类 核酸合成酶类 核酸修饰酶类 核酸内切酶核酸外切酶 DNA聚合酶RNA聚合酶DNA连接酶 甲基化酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 磷酸酶 5’ 5’ G C A A T G C T T A G C C A T C G T T A C G A A T C G G T A 核酸外切酶 核酸内切酶 核酸外切酶 5’ 5’ G C A A G C T T T A G C C A T C G T T C G A A A T C G G T A 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段。 存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。 AGCT AGCT AGCT AGCT AGCT NNNNN NNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNN NNNNNNNN NNNNNNNNN NNNN NNN Alu Ⅰ （+） （-） 电泳 一、限制酶概念提出的背景 20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如E coli K株的噬菌体只能感染E coli K株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。 1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶. E coli K株 噬菌体 E coli K株 其他 E coli 菌株 限制现象 限制性内切酶 能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。 NNNNNNNNNNNNGGATTCNNNNNNNNNNNNNNN Bam H Ⅰ 5’ 3’ NNNNNNNNNNNNAGCTNNNNNNNNNNNNNNN Alu Ⅰ 5’ 3’ 二、限制性核酸内切酶的分类 根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。 I 类：不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。 Ⅱ类：基因工程的工具酶。 Ⅲ类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点25 bp～27 bp，对分子克隆操作亦无实用意义。 三、限制性核酸内切酶的命名原则 限制酶的命名是采用Smith和Athens提议的方案，即名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母，大写；第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母，小写；如果它的来源菌还有株系，则有第4个字母；最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号。前三个字母用斜体表