利用Red重组系统快速构建基因打靶载体.pdfVIP

中国生物工程杂志 China Biotechnology ，20 11，31 (10):88-94 * 利用Red 重组系统快速构建基因打靶载体 1 2 1 ＊＊ 姜 丽 叶湘漓 李大力 (1 华东师范大学生命科学学院生命医学研究所 上海 20024 1 2 湖南师范大学医学院 长沙 4 100 13) 。 摘要 基因敲除小鼠模型是在哺乳动物体内研究基因功能最可靠的方法之一 利用常规的分子 ， 克隆的方法构建基因打靶载体往往工作周期长 对于难度特别大的基因有时甚至无法完成打靶 。 Red ， 50bp 载体的构建 通过合理应用 重组系统和低拷贝中间载体 利用 的同源重组序列直接从 BAC ; ， 载体中克隆了长片段的小鼠基因组序列 将得到的基因组序列再次通过重组和改造 构建了 Gpr56 ， 。 等基因的完全敲除并带有报告基因的打靶载体 实现了打靶载体的快速构建 关键词 重组工程 打靶载体构建 Red 重组酶 中图分类号 Q789 ， 。 ， AscI 基因敲除 又称基因打靶 该技术是将含有与靶 能的感受态细胞 引入 酶切位点并利用氯霉素抗 ， ; AscI ， 基因片段同源的重组载体导入小鼠胚胎干细胞 通过 性筛选到阳性菌落 最后利用引入的 酶切位点 引 载体同源臂与胚胎干细胞染色体上同源序列间的重 入报告基因(GFP 或lacZ)和新霉素抗性筛选基因neo 。 组， DNA DNA 将外源修饰过的 序列与目的基因的 片段 由于报告基因以相同的编码框连入被敲除基因的基因 ， ， 发生交换 导致目的基因失活 从而达到基因敲除的目 DNA ， 组 中 因此报告基因是被拟敲除基因的启动子直 。 的 通过比较靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗 ， 接调控 通过检测其活性就能监测内源基因的表达 ［1-3］ 传特性的改变进行目的基因功能的研究 。 情况。 3 ， 现阶段构建基因敲除载体的方法主要有 种 即 因为整个实验过程不需要进行大片段的PCR 扩 PCR 、 、 基于 扩增 酶切和连接等技术的传统构建法 利用 ，