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定量PCR基本原理及方法 基因有限公司 黄妤 荧光定量PCR基本原理 荧光定量PCR标记方法 荧光定量PCR不同方法学的应用 内容 定量PCR技术的产生 1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB加入PCR反应体系，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 核酸 ? 染料荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB 荧光定量PCR基本原理 Real-time Chemistries PCR的理论方程：Y=x×(1+ Ev)n Y：扩增物数量； X ：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数 1. 终点法定量原理 前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同 原理：根据扩增产物的量计数反应物中原始分子数，即： lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数) 2. 实时检测法定量原理 前提：在最佳实验、相同Ev以、扩增产物量相同 原理：反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即： LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数) 荧光定量PCR的定量原理 阈值：PCR扩增信号进入相对稳定的对数增长期时的荧光值。 阈值（threshold）的设定 PCR efficiency =[10(-1/slope)]-1 Where slope=1/m Slope -3.322 100%efficiency PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。 Ct值——n：扩增循环数 n: 扩增循环数的确定 logN=log N0 +nlogE n=Ct 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。 Ct值与起始模板的关系 Y轴—Ct值 X—起始拷贝数的对数 标准曲线 由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线 计算待测样品的初始模板浓度 log N0 =-Ct logE+logN 绝对定量——未知浓度的样品与标准曲线相比较 内掺式染料 SYBR Green I, LC Green 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons FRET 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) LUX 荧光定量 PCR 标记方法 5’ 3’ 5’ 3’ SG Excitation SG SG SG SG Emission 内掺式染料 SYBR-Green I 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG Excitation Emission 内掺式染料 SYBR-Green I R Q 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Excitation R Q Q R Q R Excitation 双标记探针（Taqman Probe） R Q Excitation R Q Q R Excitation Emission 分子信标（Molecular Beacon Probe） Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: LC Red 640 Excitation Emission Transfer 荧光共振能量传递（FRET Probe） 荧光定量PCR不同方法学的应用 研究目的 标记方法 定量分析（基因拷贝数的绝对定量，基因表达调控的相对定量） Sybr-Green (LC Green), Taqman, Molecular Beacon, etc 研究目的 基因型分析（SNP、突变型分析） Taqman, Molecular Beacon, FRET, LC Green 熔解曲线分析 Sybr-Green, LC Green, Molecular Beacon, FRET 某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达检测结果 （自备标准品，检测样品做复管） 绝对定量 某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达相对定量分析，下图为用??Ct法得出的分析结果 。（自备标准品，检测样品做3次