发情猪血清对猪卵母细胞体外成熟和后期发育影响.pdfVIP

发情猪血清对猪卵母细胞体外成熟和后期发育的影响 1 2，1 吴坤 ，刘娣 1．东北农业大学 动物科技学院，黑龙江 哈尔滨 150030 ； 2．黑龙江省农业科学院 畜牧研究中心，黑龙江 哈尔滨 150086 Email ：kunwu@126.com 摘 要：本试验旨在研究发情猪血清 （EPS ）对IVM 系统中卵母细胞的细胞核成熟、细胞质 成熟以及后期发育潜力的影响。结果表明：1.EPS 能有效促进核-质成熟同步化并提高卵母细 胞的核成熟率，添加10%EPS 组取得了71.5%的核成熟率，显著高于其他两组；2.使得更多 的原核胚跨越了4-细胞阻滞，10%EPS 组取得的桑椹胚率(33.3%)和囊胚率(11.1%)显著高于 其他两组；2. 5%EPS+5%FCS 组的卵裂率与 10%EPS 组相近而显著高于 10%FCS 组，说明 EPS 能有效提高卵裂率；3. 5%EPS+5%FCS 组和 10%FCS 组的4-细胞率、桑椹胚率、囊胚 率显著低于10%EPS 组，说明 10%浓度的EPS 对于猪IVM 培养系统是必要的。 关键词：猪、发情母猪血清、卵母细胞、体外成熟 1.引言 血清是一种成分十分复杂的物质，它所包含的激素、生长因子、细胞因子、氨基酸、酯 1 类、维生素等物质在哺乳动物卵母细胞体外成熟与发育过程中发挥了重要的调节作用 。Cran 等(1985)2、3 的研究表明在LH峰出现 37 小时后卵母细胞才能完成核成熟。随后Funahashi等 (1993)4也提出：在卵母细胞IVM前20h加入激素、后20h去除激素，可以更大程度地模仿体 内激素的动态变化，促进卵母细胞的核-质成熟。由此提示人们，在体内动态生长环境下， 血清中激素的浓度以及它依据生理周期所发生的时程变化可能是影响卵母细胞成熟的重要 原因。本试验旨在探讨发情猪血清（EPS ）在卵母细胞体外成熟和体外发育过程中的作用。 2.材料与方法 2.1 培养液 基础培养液为 NCSU-23 加 10%的猪卵泡液（PFF ）。操作液是 Dulbecco 磷酸缓冲液 （mPBS）。后期发育培养液为NCSU-23+6 mg/ml BSA 。 2.2 发情猪血清（EPS ）的制备 在实验室所属的种猪繁育基地内选定一只年轻健康母猪作为发情母猪血清EPS 的供体 猪并记录其发情周期。在新一轮发情周期的第一天采集母猪前腔静脉处新鲜血液 20ml 。提 取血清、灭活，分装后保存在-200C冰箱中冷冻备用。 2.3 猪卵母细胞的获得与成熟培养 自本地屠宰场收集卵巢，至于无菌保温瓶中带回实验室，用注射器吸取直径为2-8mm 卵泡中的卵母细胞。选择有完整卵丘包被的卵母细胞进行培养。培养条件为：370C恒温、 5%CO2相对浓度、相对饱和湿度。 - 1 - 2.4 猪卵母细胞的后期发育 体外培养 42 小时的卵母细胞，移入含 2%透明质酸酶的溶液中，用微量移液器反复吹 打200 次，至卵丘细胞完全脱离。用mPBS 将卵母细胞清洗3 –5 次，清洗后在相差显微镜 下鉴定第一极体的排放。鉴定成熟的卵母细胞，以7% 的乙醇激活7min ，并进入后期培养。 2.5 猪卵母细胞的显微镜观察 体外培养24 小时，观察卵丘细胞的扩展情况；体外培养42 小时，观察第一极体的排放， 并统计成熟率；体外成熟的卵母细胞经激活后第2 天，观察卵母细胞的卵裂情况，并统计卵 裂率；第4 天观察卵母细胞进入4-细胞期的情况，并统计4-细胞率；第6 天观察卵母细胞 的桑椹胚情况，并统计桑椹率；第8 天观察卵母细胞的囊胚情况,并统计囊胚率。 2.6 数据处理 所得数据以百分数T 检验及平均数T 检验进行