人类免疫缺陷病毒-1整合酶区标准突变株真核表达载体的构建及其应用.pdfVIP

· · 生堡篮鎏痘盘查!!!!生!旦筮i!鲞筮3魍￡!i!』!!!!堕坠!!丛!堡!!!!!!y!!：!；!盥!：i 129 ● 基础论著 ● 人类免疫缺陷病毒一1整合酶区标准突变株 真核表达载体的构建及其应用 徐树莹 乔录新 徐萌 袁霖 李庆 丁渭 石英 陈德喜 【摘要】 目的 构建整合酶区标准突变株真核表达载体，并进行初步功能验证，为HIV-1表型耐 药研究提供技术方法。方法采用点突变的方法，以质粒pNL4—3．Luc．R-E为模板，扩增整合酶区片段 (含突变位点Y143、Q148)，经过BamHI和XhoI双酶切，通过T4DNA连接酶将纯化的PCR产物与 1I和X^o 经过Bgl Gateway“技术的BP／LR反应，将LTRgagpol片段重组到pNL4—3一attR，构成整合酶区标准突变质粒。 在聚乙烯亚胺(PEI)转染试剂介导下，与水泡性口膜炎病毒的外壳糖蛋白质粒共转染HEK293细胞，得 到HIv一1假病毒，应用整合酶抑制剂拉替拉韦与野生株假病毒进行表型耐药比较，将制备的病毒效价 按4：1的比例感染HEK293细胞，同时加入拉替拉韦，终浓度为1 h后测荧光素酶报告 Fmol／L，感染48 基因。样本间抑制率比较采用单因素方差分析。结果 带有整合酶区主要突变位点的HIV一1标准耐 药株(pNI．4—3一Q148R、pNL4—3一Y143H)构建成功。应用1 umol／L拉替拉韦进行表型耐药检测时，野生 4)和Q148R耐 型病毒对拉替拉韦最为敏感，报告基因数值平均为1．72×103，Y143H耐药株(1．18×10 药株(2．82×104)对拉替拉韦表现为耐药，对三者相对荧光素酶单位取对数值做统计学分析，野生株与 Y143H耐药株相比差异有统计学意义(F一38．800，P一0．025)，野生株与Q148R耐药株相比差异有统 敏感性更低，差异具有统计学意义(F一22．551，P一0．042)。结论成功构建了带有整合酶区主要突变 位点的HIV-1标准耐药株载体，并成功表达，为研究临床HIV一1标本表型耐药典定了基础。 【关键词】HIV一1；整合酶类；HIV整合酶抑制剂；点突变；质粒；表型；抗药性，病毒 Constructionand of vectorofhuman virus-I applicationeukaryoticexpression immunodeficiencyintegrase standardmutantXu Luxin，Xu Lin，Li Wei，Shi Shuying，QiaoMeng，YuanQing，Ding Ying，Chen Medical Youan Dexi．DepartmentofInfectiousDiseases，CapitalUniversityAffiliatedBeijing 100069，China Hospital，Beijing Cor author：ChenDexi，Email：dexi09@yahoo．corn rf?s户。卵di行g Toconstruct vectorofhuman virus [Abstract]Objectiveeukaryoticexpression immunodeficiency standardmutantandconduct functional tO (HIV)一1