提高RT-PCR的灵敏度与产物长度摘要RT－PCR已经成为.pdfVIP

中国试剂网 3.12.4.5 提高 RT-PCR 的灵敏度与产物长度 摘要 RT －PCR 已经成为研究者确定感兴趣的器官、组织或细胞中mRNA 转录本出现、结构和表 达水平的基本方法。RT －PCR 的基本步骤包括：首先对样品中出现的所有mRNA 合成一个 cDNA 拷贝，接着扩增感兴趣的基因。因为两个步骤中使用的反应缓冲液不能兼容，所以这 两个步骤（RT 和 PCR ）通常分别进行。即使有些试剂盒能将两个步骤合而为一，但是同样 因为上述的缓冲液不兼容性，极大地限制了检测灵敏度。Eppendorf 设计了一个含有全新化 学物质的新试剂盒，使一步法 RT －PCR 更加有效，在两步法实验中可以获得更高的灵敏度。 本文将对新试剂盒的表现进行检验。 简介 逆转录（RT ）以及随后进行的PCR （RT －PCR ）是RNA 分析中使用得最广泛的技术之一。 如果需要平行分析多个 RNA 样品，首选方法为一步法 RT －PCR 。如果要扩增困难目标片段 或从单一 cDNA 池中扩增多重目标片段则会选择两步法。Eppendorf 推出的全新的 cMaster RTplusPCR 系统适用于各种 RT －PCR 应用。它含有一种全新的重组逆转录酶和一种具有高 保真性的 PCR 酶混合物。另外，RTplusPCR 反应缓冲液能够自动调节镁离子浓度，因此这 一重要成分的浓度无需优化。这种自我调节的效果是通过对镁离子的弱螯合作用来实现的。 如果镁离子浓度过高，螯合剂会与过剩的镁离子结合，如果反应（Taq 或 DNA ）需要镁离子， 镁离子就会被释放出来。这种创新技术提高了 cMaster RTplusPCR 的灵敏度和特异性。使 cMaster RTplusPCR 试剂盒既能进行一步法，又能进行两步法 RT －PCR ，而且具有很大的动 力学检测范围，能扩增得到的 PCR 产物长度范围也很大（一步法反应最长可扩增5.3 kb 片段； 两步法方案最长能扩增 12.3 kb 片段）。 下面的实验可以展示该试剂盒在不同应用中的表现。 实验 1 关注新试剂盒在一步法 RT －PCR 中卓越的灵敏度。而在一步法应用中，最重要的因 素就是能够采用尽可能少的目标材料进行有效工作。 实验 2 显示应用一步法方案进行长距离 RT －PCR 不再是个难题。试剂盒中创新的缓冲液能 同时保证逆转录酶和高保真酶混合物都具有最佳延伸性。 中国试剂网 3.12.4.5 本系统提供的两步法 RT －PCR 备选程序适用的模板范围很广。实验 3 描述了对不同模板的 扩增情况。这个新的系统能为所有的 RT 目标提供全面解决方案，不论需要扩增的片段是中 等长度还是极长，不同来源的总 RNA 中转录本是低丰度还是高丰度。 材料和方法 Eppendorf cMaster RTplusPCR 系统 Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic 试剂盒 所有的 PCR 反应均在 Eppendorf Mastercycler® gradient 梯度 PCR 仪上进行。 实验 1：一步法灵敏度检测RT －PCR 扩增目标：500 bp 的人 α微管蛋白 mRNA 片段。 模板 RNA ：从人HELA 细胞中纯化的总 RNA 。反应中应用的模板浓度从 1μg 递减至 10pg。 方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 系统，标准一步法 RT －PCR 方案。1:10 稀释 RTplusPCR 缓冲液，镁离子终浓度 2.5 mM ，反应总体积 50μl 循环参数： 循环 步骤 温度 时间 描述 1x 1 50°C 30 分钟 逆转录 1x 2