植物乳杆菌食品级基因工程受体菌的筛选.pdfVIP

植物乳杆菌食品级基因工程受体菌的筛选1 范硕，田洪涛，郝彦玲, 林希瑾，秦伟，罗云波* 中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京（100083 ） E-mail ：yunbol@ 摘 要：从韩国泡菜中分离出五株乳酸菌，经形态学、生理生化鉴定和 16S rDNA 全序列分 析，将测序结果在GenBank 上进行BLAST 比对，构建系统发育树，鉴定出五株菌均与植物 乳杆菌的亲缘关系最近。选择没有天然质粒存在且是Nisin 敏感的菌株作为食品级基因工程 受体菌的候选菌株，使用带有Nisin 免疫选择标记的食品级克隆载体 pLEB590 对其进行转 化，优化电转化条件，得出使用含有终浓度为 6%甘氨酸的 MRS 制备感受态细胞，2kV 电 压下，最高可得到8.204×103 转化子/µg 质粒。携带载体pLEB590 的菌株可以耐受最大为550 IU /ml 的Nisin 浓度，并且在Nisin 选择压力下能够保持外源质粒的遗传稳定性。 关键词：植物乳杆菌，分离鉴定，食品级，受体菌，转化效率 目前所研究的食品级基因工程受体菌主要是乳酸菌，种类主要包括乳酸球菌、乳酸杆菌 和双歧杆菌。其中乳杆菌属由于其自身的免疫原性和优良的胃肠道定植能力使得其作为食品 【 】 级基因工程受体菌的应用前景十分广阔 1 。乳杆菌属中的植物乳杆菌是人体肠道内常被分 离到的乳杆菌，其在蔬菜制品的发酵、干酪的成熟、北欧干肠风味的形成、共轭亚油酸的发 【 】 酵生产以及产生细菌素拮抗致病菌等方面被广泛应用 2 。虽然 Nisin 作为一种高效、无毒 的天然食品防腐剂被广泛地应用于食品中，但 Nisin 免疫基因作为食品级筛选标记却是在 【 】 2002 年才被首次使用 3 。本研究旨在从韩国泡菜中分离鉴定得到植物乳杆菌，并从中筛选 出有潜力成为以Nisin 免疫基因作为食品级选择标记的基因工程受体菌。 1. 材料 1.1 菌株和质粒 植物乳酸杆菌（Lactobacillus Plantarum ）分离自韩国泡菜；E.coli DH5ɑ 感受态购自 TIANGEN 公司；质粒 pLEB590 （3.1kb，以 nisI 作为选择标记的 Nisr ，pSH71 复制子，表 达 nisI 的组成型启动子P45 ）由原中国科学院微生物所郭兴华研究员惠赠。 1.2 试剂和溶液 Nisin 购自 Sigma 公司；甘氨酸购自 Amresco 公司；Ex TaqTM DNA 聚合酶和超螺旋 DNA Marker 购自大连宝生物；T4 DNA 连接酶购自 Promega 公司；细菌 DNA 提取试剂盒和 DNA 胶回收试剂盒购自 TIANGEN 公司；其它试剂均为国产分析纯。 1.3 培养基 乳杆菌生长用MRS培养基、分离菌株用SL培养基，培养基的成分和配制参见《乳酸细 【 】 菌分类鉴定及实验方法》4 。 2. 方法 2.1 植物乳杆菌的分离、纯化 -6 -7 -8 取泡菜汁用生理盐水进行10倍稀释，取10 、10 、10 稀释度的菌液各100µL涂布在SL 1 本课题得到国家 863 项目（项目名称：乳酸菌食品级表达体系构建的研究）资助。 - 1 - 固体培养基平板上。37℃温箱培养36～48 h ，待长出菌落后，挑取单菌落镜检保存并进行实 验研究。 2.2 植物乳杆菌的鉴定 2.2.1 形态学鉴定和生理生化鉴定 按照《乳酸细菌分类鉴定