肺炎链球菌HMGS基因克隆及同源模建.pdfVIP

东医药2010年第50卷第 1期 肺炎链球菌HMGS基因克隆及同源模建 贲亚硎 ，崔古贞 。张青叶’。刘德立 (1江汉大学，武汉430016；2华中师范大学生命科学学院； 3华中师范大学化学学院) 摘要：目的 构建肺炎链球菌HMGS同源模建。方法 采用基因工程技术克隆肺炎链球菌HMG．CoA合成酶 (HMGS)基因，测序获得HMGS基因序列，以粪肠球菌 HMGS(IX9E)为模板，通过 SYBYL7．0软件构建同源模建。 结果 成功地构建了肺炎链球菌HMGS同源模建。结论 获得的肺炎链球菌HMGS基因序列与 IX9E的基 因有 53％同源序列；可以为根据肺炎链球菌HMGS同源模建寻找结构类似物来开发新药奠定基础。 关键词 ：肺炎链球菌；HMGS；克隆；同源模建 中图分类号：R378．99 6 文献标志码：B 文章编号：1002~66X(2010)Ol-0082~2 甲羟戊酸途径是肺炎链球菌发育增殖必需的代 应程序：95℃加热预变性5min后，95℃变性30s， 谢途径，甲羟戊酸的代谢过程是一种潜在的新型抗 5O℃退火30s，72oC延伸 1min，30个循环，最后72 生素药物作用靶标。目前，用计算机分析三维结构， ℃延伸 10rain，4℃保温。1．0％琼脂糖凝胶 电泳检 用同源模建的方法寻找结构类似物来研究新药的开 测PCR产物。采用DNA限制性内切酶酶切载体和 发是一个新的领域，有非常高的实用价值。2006年 样品，低熔点琼脂糖法回收DNA。DNA片段的回收 6月 ～2008年 6月，本研究选择肺炎链球 菌的 采用 DNA凝胶 回收试剂盒。回收的载体与外源 HMG—CoA合成酶(HMGS)作为甲羟戊酸途径的靶 DNA片段按摩尔比1：10，并加入 1～3uT4DNA连 酶，以粪肠球菌 HMGS的晶体结构为模板，通过 接酶和 10×连接缓冲液，16cc连接过夜。重组质粒 SYBYL7．0软件 ，构建肺炎链球菌 HMGS的同源模 经适当限制性内切酶消化，电泳分析确证并鉴别外 建 。 源片段及插入方 向，或采用 PCR鉴定阳性重组子 ， 1 材料与方法 DNA测序进一步鉴定。 1．1 材料 肺炎链球菌购 自武汉大学基础医学院。 1．2．2 同源模建 将 PCR获得肺炎链球菌HMGS pET-28a由本室保存。氨苄青霉素、卡那霉素均购 序列输入到SWISS—MODELsever网站 自动建模。经 于武汉市亦新生物技术有限责任公司。DNA限制 初步序列同源模板搜索，选出了以下几种原核生物 性内切酶、T4DNA连接酶、溶菌酶、TaqDNA聚合酶 同源性大于30％的已知晶体结构的蛋 白作为模板 分子，HMGS模板分子晶体结构 PDB代号分别为： 均购 自TaKaRa生物有限公司。SWISS—MODELsev— 1X9EE¨ 1HDBC引 1YSLE¨ 1XPKE lTvz… ， ， ， ， ， 它们 er，SYBYL MolecularModelingSoKware，PROCHECK 与 目标序列之间同源性在47％一53％。按照已知 软件。其余均为分析纯。 晶体结构的粪肠球菌HMGS序列…与 SP—HMGS之 1．2 方法 间的叠合方式模建 SP—HMGS空间三维结构。由 1．2．1 肺炎链球菌 HMGS基因PCR 根据 Cen— SWISS模建出的肺炎链