脐血干细胞移植体内诱导分化为肝细胞的实验与研究.pdf

暨查王塑瞧鏊撞链直透墨筮鼗盏旺麴监笪塞銎班究 主塞擅要 脐血干细胞移植体内诱导分化为肝细胞的实验研究 中文摘要 目的通过脐血干细胞移植在体内诱导分化为肝细胞的实验研究， 进一步为脐血干细胞向肝细胞的分化提供证据，证实脐血干细胞的可塑 性，为将脐血干细胞移植应用于治疗终末期肝病的研究奠定基础。 方法 ①使用采血袋法采集脐血标本，分别采用改良HES(羟乙基 淀粉)沉降分离法和Ficoll分离法两种方法分离脐血于细胞，比较分离前 后有核细胞(nuclearcell，NC)数、分离后CD34+细胞数、分离后有核 细胞回收率及台盼蓝拒染率。了解分离后有核细胞的数量和质量，为脐 血移植创造条件。 ②选用BALB／C裸鼠，将其随机分成实验组和对照组，实验组再根 o 据输注有核细胞数的不同分成A、B、C三组。采用C60治疗仪Y．射 线对实验组和对照组进行亚致死剂量350my照射，照射后3小时内在 无菌条件下由裸鼠尾静脉输入分离的人新鲜脐血有核细胞。实验A、B、 1．0X C三组分别输入NC 107个／只、2．0X107个／只、3．O×107个／只，对 照组经尾静脉注入等体积无菌生理盐水。移植后第l、2、3、4和8周分 别检测实验组和对照组外周血白细胞，移植后第4、6和8周通过流式细 胞仪检测外周血人源性CD34+和CD45+细胞水平，了解人鼠细胞嵌合情 况。移植后一个月对实验组A、B和对照组裸鼠分别按0．4 ml／kg注射用 玉米油稀释到100 pl的四氯化碳(carbon 注射等体积生理盐水。通过cCl4造成肝脏损伤，诱导脐血干细胞归巢到 跹鱼王鲴跑整焦佳内透昱盆毡盏旺细胞曲塞殓婴宜 生塞擅要 肝脏，分化为肝细胞，建立脐血移植体内分化肝细胞的人鼠嵌合模型。 脐血移植后2个月(CCh注射后1个月)经免疫组化和RT-PCR检测鼠 肝，了解人源性CKl8、CKl9和人源性白蛋白(ALB)的表达。 结果l、脐血采集和有核细胞的分离。收集脐血10份，脐血量 65～124 ml，平均87 ml。经比较，改良HES(羟乙基淀粉)沉降分离法和 Ficoll分离法分离前的脐血量、有核细胞密度和细胞数差异无统计学意义 (尸0．05)，分离后改良HES法有核细胞数、CD34斗细胞数、有核细胞回 收率(为脐血分离后的有核细胞数与分离前的有核细胞数之百分比)高 于Ficoll分离法(PO．05)；而显示有核细胞活力的台盼蓝拒染率两种方 法差异无统计学意义(P0．05)。两种方法细菌培养均为阴性。 2、脐血干细胞移植后的观测 o ①裸鼠生存情况。实验组裸鼠无死亡，对照组在C 60Y射线照射 后死亡4只，CCl4注射后死亡3只。 ②白细胞数变化情况。测量时间的不同及不同组注入脐血有核细胞 数的不同对代表造血功能的WBC数的差异有影响(F=722．146， P=O．000)。脐血移植前及移植后第8周实验组各组与对照组之间WBC 数差异不明显(尸O．05)；移植后第1、2、3、4周实验组各组与对照组 之间WBC数不全相同(Po．05)。各时间点WBC水平与移植前相比， 移植后实验组各组与对照组WBC均下降，第l周WBC数最低，但随时 间的延长WBC逐渐增加，到第4周实验组各组WBC已恢复至移植前水 平，而对照组WBC水平仍较低(／--0．000)，第8周已恢复正常。 ⑧外周血中的huCD34+细胞和huCD45+细胞在4周时均已出现， 但总体水平较低。实验组A、B、c三组同一组不同时段人源性CD34+、 2 匝鱼王细胞整撞佳囱透昱爱毡盏星王鲴胞鲍塞坠班究 虫塞擅噩 时段均较实验组B和实验组c低(P0．05)：而实验组B和实验组C的 许和样本含量较少有关。