聚合酶链式反应-变性梯度电泳技术(PCR-DGGE)与研究中国白酒大典中微生物群落结构.pdf

摘要 摘要 酒曲酿造是我国优势传统发酵食品白酒酿造的技术特征和关键技术。大曲以小麦等 谷物为原料固态生料发酵而成，大曲作为白酒生产中微生物的主要来源，其质量直接关 系到酒的出酒率及酒质。长期以来，由于研究技术手段的限制，对白酒大曲微生物区系 的研究和认识还非常有限。 为克服培养方法的局限性，采用建立在分子生物学技术基础上的未培养技术，从未 培养角度探究大曲微生物群落结构组成对于深入白酒大曲微生物群落特征的认识，丰富 我国传统酿造食品微生物学的机理的研究，具有实践和理论意义和价值。 本文运用PCR．DGGE方法对国内具有代表性的不同工艺白酒大曲的微生物群落结 rRNA 构进行了研究。分别基于细菌的16S枞V3基因、酵母的26SD1基因和真菌 的18Sr鼢舱基因对大曲中的细菌、酵母和真菌的群落结构进行了分析。通过DGGE优 势条带的切胶回收及测序鉴定获取了大曲微生物种群结构信息。 研究结果表明： rRNA 1)与传统分离培养方法研究相比，本研究首次基于细菌的16S V3基因DGGE 揭示了白酒大曲中乳酸菌的种群多样性，多种乳酸菌存在于不同工艺大曲中。所鉴定出 的乳酸菌包括耽汹P砌c汤口厂肠、三口c幻6口c讲螂p册括、￡．加舰胁淞、三．膨，．聊P刀彻聊、三．pD，z咖。 细菌是中国大曲最具特点的微生物。同时DGGE检测到了传统培养方法未检测到的嗜麦 芽窄食单胞菌、假单胞菌、葡萄球菌及高温放线菌； 2)在真菌的分析研究中，针对传统培养方法和己报道未培养方法研究多集中在细 菌群落结构的状况，分布基于酵母的26S rRNA 和真菌群落结构进行了研究。酵母26S D1区基因的DGGE研究显示 勋cc办口阳缈9矽括．肋甜，袒M、P耙办肠口，zD聊口肠普遍存在于所有大曲中，且在整个酵母群落 中处于优势地位，弥补了传统培养方法在反应优势菌群分布方面的缺陷。传统培养方法 研究认为大曲酵母群落认为大曲中酵母主要为酿酒酵母、汉逊酵母、毕氏酵母、拟内孢 霉四大类酵母，本研究使用DGGE方法均检测到了此四大类酵母，且还检测到了 乃fc办D印D加以船口办村、眈6口，归聊弦嚣办口瑚P行玎、z，a瑚e疗f口印D厂口删讲把，珊D刀砌等酿酒工业中 rRNA 认为重要的非酿酒酵母。犁头霉及米根霉在真菌18S DGGE图谱中显示出明显的 优势地位。除犁头霉、米曲霉及烟曲霉以外，利用18SrRNA引物还检测到了＆聊沈妇 8Sr】卧『A 6甜^拓厂f等酵母。真菌1 DGGE图 矶p豇Ⅺ凰、C锄旃如口肋c咖ff、勋c砌口阳，，移彬es 蛰》、≯¨芦≯弩麓∥， 谱Sh肌non．Wiener多样性分析结果显示单粮曲真菌多样性均低于杂粮曲； 3)地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌均为大曲中优势芽孢杆菌。PCR扩增的偏好性会 rI矾A 引起细菌16S V3区引物很难将芽孢杆菌进行DGGE分离。通过利用巢式PCR获 rI矾A 取芽孢杆菌专一性基因，将芽孢杆菌的16S V9区基因作为DGGE靶基因成功构