马立克氏病病毒感染鸡羽髓蛋白质组学与研究.pdf

摘要 disease 马立克氏病病毒(Marek’S diseasevirus diseasevirus 1，MDVl)、血清2型(Marek’S 2，MDV2)和 serotype serotype 火鸡疱疹病毒(Turkey 疱疹病毒科禽疱疹病毒2型，引起以鸡免疫功能障碍、恶性淋巴肿瘤和中枢神经系统损伤为特征 的马立克氏病(Marek’Sdiseas，MD)，是鸡的重要传染病。马立克氏病同时也是首个通过疫苗 进行控制的肿瘤性疾病，因此受到医学界、兽医学界、病毒学界的广泛关注。 MDV具有严格的细胞结合性，感染的细胞至少有4种类型，即B细胞、T细胞、巨噬细胞 follicl 及羽毛囊和肾的上皮细胞。但羽髓上皮细胞(Feather 成游离的有囊膜的病毒粒子的部位。大量有囊膜的感染性病毒粒子伴随羽屑的脱落释放到环境中 成为传染源。羽髓(Feather pulp)对于MDV的复制、装配和MD的传播流行具有重要意义，因 此感染MDV羽髓组织的相关研究已成为MD的研究热点之一。但目前此类研究大多从DNA或 mRNA水平上进行个别基因或蛋白的检测。蛋白质组学技术可以大规模鉴定蛋白质，更真实地反 映蛋白质的表达情况。本文建立了适宜羽髓组织蛋白样品的双向电泳方法，对感染MDV强毒鸡 羽髓进行蛋白质组学分析，并对感染不同毒力MDV毒株鸡羽髓组织差异蛋白质组学进行研究。 1． 建立鸡羽髓蛋白双向电泳方法 以SPF鸡羽锈组织为研究对象，以固相pH梯度胶条进行等电聚焦为第一向，采用垂直十二 烷基磺酸钠．聚丙烯酞胺凝胶电泳为第二向进行双向电泳。对上样量、不同pH范围胶条、一向设 3．10范围13 置参数、凝胶染色方法等进行一系列优化。结果显示羽髓组织在pH cm的2-DE胶 上可以得到较好的分离效果，采用R350热考染染色效果较好。应用软件对凝胶图谱进行初步分 析，可分辨的蛋白点约700个，不同样本问的匹配率大于80％。本研究建立了适宜鸡羽髓蛋白的 双向电泳方法，分辨率及可重复性均较高。该方法的建立为羽髓组织蛋白质组学研究提供了可靠 的技术基础。 2． 强毒力MDV感染鸡羽髓差异蛋白质组学研究 针对MDV从感染到发病的四个阶段，利用双向电泳技术对感染MDV强毒株后4d、7d、14d 和21d羽髓组织蛋白的差异表达情况进行分析。结果显示在MDV感染后四个时期各有显著差异 表达蛋白点分别为2个、8个、25个和9个；通过质谱技术鉴定出29种蛋白质，包括能量代谢 相关蛋白、增殖和凋亡相关蛋白、细胞骨架蛋白、信号传导蛋白、转录相关蛋白、免疫相关蛋白 和其他功能蛋白。鉴定的诸多种差异表达蛋白为进一步揭示羽髓中MDV的复制、基因的表达以 及宿主的应答等打下基础。 3． 强、弱毒株感染鸡羽髓差异蛋白质组学研究 针对MDV强、弱毒株的感染可能引起宿主细胞在蛋白水平上的表达情况不同。采用双向电 泳技术，将MDV强毒GA株和弱毒疫苗株CVl988感染的羽髓蛋白样品分别进行双向电泳分离； 并分析在MDV复制的四个阶段，强、弱毒株感染后引起宿主蛋白差异表达情况。结果显示感染 后7d检测到4个显著差异表达蛋白点，其中相对于疫苗株CVl988感染组，GA株感染后上调表 达2个，下调表达2个。感染后14d检测到6个显著差异表达蛋白点，相对于同时期疫苗株CVl988 感染组，这些蛋白点在GA株感染时全部上调表达。感染后21d检测到5个显著差异表达蛋白点， 其中相对于疫苗株CVl988感染，GA株感染后上调表达4个，下调表达1个。利用质谱技术鉴 nuclear D-like、 定出7个蛋白点代表5种蛋白质分别是：LASP．1、heterogeneousribonucleoprotein L．乳酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶和甲硫腺苷磷酸化酶；对