云南野生稻遗传特性及优良基因克隆研究.pdf

四川大学博士论文 云南野生稻遗传特性及其优良基因克隆的研究 专业：遗传学 博士生：程在全 指导教师：张义正教授 黄兴奇研究员 中文摘要 云南野生稻是珍贵的野生植物资源，蕴藏着十分丰富的优良种质基因，是 改良栽培稻，可供人类长期持续发掘利用的重要基因宝库。野生稻过去在云南 分布广，生态类型多，但是，随着人类活动其适生环境遭到破坏，而处于濒危 状态。因此，开展对云南野生稻现存资源的调查和保存保护研究，及主要遗传 特性和有关基因(片段)的分离研究，有助于促进对野生稻资源的保存、研究 和利用，具有重要的理论和实际意义。 1云南野生稻资源最新分布状况调查和营养成分研究 对云南野生稻现存分布情况进行了较为系统的调查，新发现了1个普通 野生稻自然分布居群，2个药用野生稻自然分布居群和5个疣粒野生稻自然分 布居群。通过RAPD和ISSR分子标记分析，发现居群间的遗传距离大于居群内 不同点或植株间的遗传距离。揭示了云南普通野生稻不同类型材料与具 A’A’基因组的国内其它地区普通野生稻代表材料的遗传距离。 首次对云南野生稻稻米总蛋白质含量、17种氨基酸含量和10种无机元素 (其中ca、Fe、zn为人体健康有益元素)的比较分析发现，野生稻稻米的蛋 白质含量最高达19-3％，一般为13％-．-16％，比栽培籼稻和粳稻的稻米蛋白质 含量高出50％80％。在人体必需氨基酸和有益无机元素中，野生稻多数种类 和类型的含量都显著高于籼稻和粳稻。发现野生稻稻米的高含量蛋白质、人体 必需氨基酸以及zn和Fe，都受遗传控制为主，可能遗传力高，但是Ca、Mn 等元素可能遗传力小。 上述结果表明，虽然云南野生稻自然资源消亡很多，但是现存资源的遗传 IX 四”I大学博士论文 多样性仍然较丰富，值得进一步深入研究和发掘利用。 2云南野生稻基因文库的构建 构建了普通野生稻、药用野生稻和疣粒野生稻的细菌人工染色体(BAC) 达到3．0-5．0，插入片段的平均长度为80kb。构建了元江普通野生稻6叶期叶 稻叶片经过白叶枯病原菌诱导处理和未处理的全长cDNA文库各1个，前者的 克隆数为1．05×10 7，重组率为97％；后者的克隆数为1×107，重组率为96％。 此外，还构建了疣粒野生稻的抑制消减杂交文库(SSH文库)，获得1，002个 克隆，重组率高达99．4％。 根据cDNA测序定结果，首次从元江普通野生稻中发现了15个与能量代谢 包括光合电子传递、ATP合成、光呼吸、氧化还原反应有关的蛋白质基因。从 自叶枯病菌处理后的疣粒野生稻中，发现83个cDNA序列与已知功能基因的同 源性较高，共有17种功能，另有21个cDNA无对应的已知功能基因，它们可 能是新基因。从疣粒野生稻SSI-I文库的部分cDNA测序分析后发现23个功能已 知的cDNA，它们不同程度地参与抗病相关多种代谢，发现了8个新基因。 3云南野生稻直链淀粉合成酶及其基因克隆的研究 首次对云南野生稻稻米总淀粉和直链淀粉含量进行了测定，结果显示，3 种云南野生稻米总淀粉含量与普通栽培稻相近，丽直链淀粉含量(10％，13％) 均显著低于栽培籼稻和粳稻。酶活测定发现，3种野生稻中的ADPG酶、SSS 酶、Q酶活性高，其主要作用是增加野生稻灌浆速率，而对直链淀粉含量的作 用不大。3种野生稻的GBSS酶活性明显低于栽培稻，但该酶活性大小则与3 种野生稻直链淀粉含量变化趋势完全吻合，说明GBSS在决定野生稻米直链淀 粉含量中起到重要作用。 利用栽培稻的Waxy基因保守序列设计引物，对3种云南野生稻的基因组 进行PCR扩增，获得了元江普通野生稻和药用野生稻的Waxy基因全长序列(第 1内含子除外)和疣粒野生稻Waxy基因部分序列。对Waxy基因序列的分析结 果表明，元江普通野生稻和药用野生稻Waxy基因有13个外显子，而疣粒野生 四jIl大学博七论文 发现，3种野生稻与栽培稻之间的DNA序列同源性低于不同栽培稻品种之间的 同源性，