染料结合2μm无孔硅胶亲和填料的制备与应用.pdfVIP

第 卷第 期 色 谱 年 月 染料结合 Λ 无孔硅胶亲和填料的制备与应用Ξ 沈 丽 熊博晖 丛润滋 王俊德 中国科学院大连化学物理研究所 辽宁大连 摘要 在 无孔硅胶表面键合 氨丙基 三乙氧基硅烷 并与三嗪染料活性蓝 Λ 反应 制得亲和色谱填料 并采用扫描电镜 元素分析 稳定性测试对此填料进行鉴定与表征 该 ? 填料具有良好的色谱性能 且对生物大分子有一定的亲和选择性 改变 值及离子强度对溶菌酶的结合量有 明显影响 可用于分离卵清蛋白 和溶菌酶 且对 球蛋白有不同的亲和作用 并可从鸡蛋清 ΑΒΧ 中制备少量溶菌酶? 关键词 亲和色谱 无孔硅胶 活性蓝 溶菌酶 卵清蛋白 球蛋白 球蛋白 球蛋白 Α Β Χ 中图分类号 文献标识码 文章编号 氨丙基 三乙氧基硅烷 搅拌回流 用苯 三氯 前言 甲烷分别抽提 烘干待用? 近年来 亲和色谱已经成为分离生物大分子最 表面改性无孔硅胶与活性蓝 在含 有效的手段之一? 传统的亲和色谱一般采用多糖类 的 磷酸缓冲液中于 凝胶作为基质存在机械稳定性差 承受压力小等缺 ε 下反应 ? 产物 依次用水 点 不能进行快速淋洗 且分离时间长 易造成生物 磷酸缓冲液 体积比为 的甲醇 水 甲 分子的变性 失活 随着高效亲和色谱的兴起与发 Β ? 醇 水洗至无色 烘干 展硅胶 金属氧化物 合成高分子材料 等都 ? 可用于亲和色谱? 年 将无孔硅胶应用 染料结合量的测定 称取 ? 加入 于亲和色谱后无孔填料因其良好的动力学和热力 溶液 加热溶解 所得蓝色溶液在 处 学性能已广泛应用于反相色谱 离子交换色 测吸光度得出染料结合量? 谱 高效疏水作用色谱 等? 本文使用粒径为Λ 的无孔硅胶表面 稳定性测试 将 置于不同 值的含 键合 氨丙基 三乙氧基硅烷 后 与活性蓝 的 缓冲溶液中 振荡 反应 所得蓝色微球 作为固 离心取上清液 在分光光度计上 处测吸光 定相可用于分离卵清蛋白 和溶菌酶 ? 度计算不同 值下染料泄漏量? 并对ΑΒΧ球蛋白有不同的亲和作用? 实验部分 色谱过程 仪器和试剂 将自制 填料以匀浆法装柱 ? 流动相采用 体 日本岛津 泵 美国 进 系 以含 和 体积分数 乙二醇的 样阀 岛津 紫外 可见检测器 色谱数据工 溶液等度洗脱 检测波长 ? 作站中科院大连化学物理研究所紫外 可见 分光光度计上海第三分析仪器厂 调速多用 结果与讨论 - 的性能 振荡器江苏国华仪器厂? ΝΠΣ ΑΧΒ 活性蓝 氨丙基 三乙氧基硅烷 由石油大学重质油国家重点实验室提供 粒径为 粒径分布偏差在 以内 测得表面积 三羟甲基氨基甲烷 溶 Λ 为 其外形见图 ? 菌酶上海生化所ΑΒΧ球蛋白公司 无孔硅胶表面积小 相应 的键合量也较 其它试剂都为分析纯? 少元素分析测得 键合硅胶 的质量分数为 键合相合成 ? 以 的质量分数为计算标准 在硅胶 无孔硅胶经酸处理 烘干 将适量硅胶于 ? ε 上的键合量为 按结晶点阵计算 硅胶 下真空干燥 加入适量 丝干燥甲苯 吡啶和 Λ Ξ 收稿日期修回日期 色 谱 第 卷 表面羟基数为 个 无孔硅胶表面羟基数为 交换作用占主导地位 因此可通过增加盐浓度来进 硅烷键合量反而大于硅胶表面羟基 行洗脱 实验还发现只用乙二醇无法将 洗脱 只 ? Λ 数 原因可能是无孔硅胶键合量太小 元素分析误差 有乙二醇和 合用才能得到尖锐的色谱峰 ? 较大也可能是硅烷化试剂发生了自聚? 图 不同 下的吸附量 Η Φιγ ΤηεαουντοφΛψσαδσορβεδατδιφφερεντΗ 图 Λ 无孔硅胶的扫描电镜图 Φιγ Σχαννινγελεχτρονιχρογραηοφ - Λ νον ορουσσιλιχαβεαδσ 溶于 溶液后 测得染料在硅 胶上的结合量为 与 所得结果 相比 结合量略有增加 载量也有增加 ? 配基泄漏一直是亲和色谱中令人头疼的问题 图 不同离子强度下的吸附量 泄漏的染料配基在紫外有吸收 会干扰蛋白质的测 定? 我们在不同 值下考察 的稳定性 Φιγ ΤηεαουντοφΛψσαδσορβεδατ 所得结果见图 由图 可发现染料在 ? 时 διφφερεντιονιχστρενγτησ ? 几乎没有泄漏在强酸性和碱性条件下泄漏量略有 实验发现同是由鸡蛋清中提出的 和 增加 但最大泄漏量仍在 以下 在本实验 在染料柱上的亲和行为却不同 不被保留 它 ? 过程中不影响蛋白质的测定? 在柱上的保留时间不随进样量的增加而变化这个 时间可认为是柱系统的死时间而全部吸附到 染料柱上 图 表明 和 在染料柱上进样 ? 的质量浓度和峰面积成正比且 的回收率在 以上 因此可用于两