豌豆中抗寒相关性miRNAs功能特异性验证及其克隆的研究.pdfVIP

第 33卷第 2期 辽宁师范大学学报(自然科学版) Vo1．33 No．2 2010年 6月 JournalofLiaoningNormalUniversity (NaturalScienceEdition) Jun． 2O1O 文章编 号 ：1000—1735(2010)02—0231—06 豌豆中抗寒相关性miRNAs功能特异性验证及其克隆的研究 王山 直莹，， 龙儿亮儿华1一 (暨南大学 生命科学技术学院，广东 广州 510632) 摘 要：以正常(对照)和寒冷诱导豌豆(PisumsativumLinn)幼苗为研究对象，用已知模式植物拟南芥中抗寒性相关 的 4种 miRNAs序列(miR3l9、miR393、miR397、miR402)设计引物 ，通过半定量 PCR法 ，检测在豌豆中正常条件和寒 冷诱导下可能m现的相关 miRNAs．在此基础上 ，选取模式植物 中已知 的miR319序列 ，设计特异 引物，寻找豌豆抗寒 性相关的miRNAs．结果表明：miR319、miR393、miR397、miR402均存在于豌豆中。并且冷处理诱导下表达量都有所上 升 ，此结果验证了抗寒性 miR家族在植物间存在保守性 的特 点；特异性寻找克隆、测序结果表 明，新的与抗寒性相关 的miRNAs也存在于豌豆中．本研究建立的寻找或验证 miRNAs的方法是可行的 ，并为在 各种生物 中 miRNAs功能 研究与应用打下 良好基础． 关键词 ：miRNAs；豌豆 (Pisumsativum Linn)；抗寒性 中图分类号 ：Q945．78；Q949．751．9 文献标识码 ：A miRNAs是一类长度约为 22个核苷酸的内源单链 RNA，它 自身不含开放阅读框 (ORF)，不具备编 码蛋白质的能力．成熟 miRNAs的5’端为磷酸基 团，3’端为羟基[】]．自2002年起，人们开始 了对植物 miRNAs的研究．3个研究小组分别报道在模式植物拟南芥 中发现了miRNAs．其中Bartel[钉研究小组 用克隆Dicer切割产物的方法l2鉴定 出 16个 miRNAs；Carrington[与 Chenc研究小组分别鉴定 出 125个小 RNA及 11个 miRNAs．随后几年 ，Palamik等利用遗传筛选技术又从拟南芥 中鉴定出一种新 miRNA—miR-JAW_7]，Wang等也从水稻 cDNA文库中鉴定 出20种 miRNAs[．接着 ，Wang[、Sunk— ar[1。]和Jones—Rhoades[1的研究小组又分别从拟南芥中鉴定出了25、26和 23种新 miRNAs．目前为 止 ，在模式生物拟南芥和水稻 中发现的miRNAs已逾 500种．一般认为植物 miRNAs的作用方式是在 RNA诱导沉默复合体 (RNAInducedsilencingcomplex，RISC)内，以完全互补的方式作用于 目标 mR— NA，最终影响生物体的形态建成和生长发育，是一类新的表达调控模式 [1．另一方面，miRNAs的表达 具有严格的时序和组织特异性 ，从模式植物拟南芥和水稻中发现的miRNAs分子 中，有许多在不同物 种间是高度保守的u ． 随着对植物 miRNAs越来越多的发现和了解 ，人们认识到 miRNAs在植物的生长发育中起到很重 要的作用．植物在各种逆境环境条件下，都以各 自特有的机制来适应．对于不同环境 ，植物所形成的多种 应答中，存在一种通过调节 miRNAs来应对环境胁迫的机制．植物在环境胁迫 因素作用下能诱导某些 miRNAs过量或低量表达 ，或直接合成一些 miRNAs，并对外界环境胁迫做出应答反应．有研究发现，干 旱、严寒和盐分会影响拟南芥 miR319c、miR393、miR395、miR397b和 miR402的表达，如 miR319c仅 由 严寒因素诱导表达，miR393和miR402受到干旱盐碱、低温或ABA信号传导(Sunkar和 Zhu2004)的 影响[1，miR395在低硫酸盐的条件下诱导表达 ，此时miR395的靶标基 因APS1(ATPsulfurylase1) 表达明显下降(Jones-Rhoades、Bartel2004L1。和 Lu等 2005_16J)． 近年