胶体电泳分析DA片段.docVIP

膠體電泳分析DNA片段 國立中興大學植物病理系 張碧芳 助理教授 前言 核酸電泳主要利用核酸帶負電荷的特性，於電場中會穿過膠體，如：agarose或polyacrylamide膠體，而朝向正極移動。因為不同分子量的核酸，在膠體孔徑中移動的速度會有差異，藉此將不同大小的核酸分開。Agarose膠體為較普遍用為電泳的材料，主要因為其製備方便及簡單，常使用在200 bp~50 kb核酸片段間的分析，且通常以水平式電泳槽來進行電泳。然而，polyacrylamide膠體的製備相較於agarose膠體則較為麻煩，且未聚合前之acrylamide具有神經毒性，可經由皮膚或黏膜吸收，在操作上更應小心。Polyacrylamide膠體電泳可有效分析小分子量的核酸片段，甚至小至1 bp，如：核酸定序，一般以垂直式電泳槽來進行。 膠體電泳的解析力 膠體電泳可分析小至數個核苷酸，大至百萬個核苷酸的染色體DNA，但它也有一定範圍的解析力，並不是一片膠體就可分析各種大小的DNA片段，故要得到好的解析力，必須要探討膠體電泳的解析範圍。常用於分析DNA的膠體電泳有兩種，一種是洋菜凝膠電泳（agarose gel electrophoresis，簡稱AGE），另一種為聚丙烯醯胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE）。這兩種凝膠，由於其濃度不同時，所形成之凝膠體的孔洞不同，故其解析範圍不同。對直線形DNA的有效分析範圍，洋菜膠常用0.3%至2.0%之濃度，可分析於1~60 kb（kilo-base pairs或kilo-base）DNA分子（見表一），而聚丙烯醯胺凝膠常用濃度為2.5%至20%，可分析1~1000 base或base -pair（bp）長度之DNA（表二）。 （資料來源：）（資料來源：）~9%之凝膠，以分析較小片段之DNA分子，其解析力極佳，依不同的凝膠濃度而有不同之解析範圍（見圖一及圖二），但所使用的電泳緩衝液種類也會影響凝膠之解析範圍（見圖一A、、（資料來源：）（資料來源：）（資料來源：）°）直角交互對換通電。另一種稱為FIGE（field-inversion gel electrophoresis），為定期將電極作180°轉換，其方式如向前電泳2秒鐘，向後電泳1秒鐘之交換進行。而最好的設計，目前以CHEF（contourclamped homogeneous electric fields）電泳，可得到最好的解析力，其設計主要為一六角形之電泳槽之六邊上，圍繞上電極，以120°角度交互作電泳。上述這三類之電泳設計，即為一般所稱之脈衝電泳（pulsed field gel electrophoresis），而電泳中之脈衝交互通電之角度以120度之解析力似乎最好。 影響電泳的因素 核酸在電泳時，其移動速率與分子量大小成對數反比，而與核酸序列的組成鹼基無關。其他影響電泳的因素有：（一）膠體濃度：濃度之高低，與膠體之孔徑大小有關。濃度高，孔徑小，適合小分子量的核酸電泳；而濃度低，孔徑大，適合大分子量的核酸電泳。一般agarose的濃度為0.3~2.0%，適合分析100~60,000 bp大小之核酸；polyacrylamide之濃度則為3.5~20.0%，適合分析6~3,000 bp大小之核酸。（二）核酸結構：不同形狀之同種DNA，在相同條件電泳，其移動速率會有所差異，如：超螺旋DNA（supercoil）、缺口性環型DNA（nicked circular）及直線型DNA（linear）等三種型態一同電泳時，超螺旋DNA移動速率最快，其次為直線型DNA，缺口性環型DNA速率最緩慢。（三）電泳緩衝液之鹽類成分：緩衝液之鹽離子濃度會影響核酸電泳結果，在高鹽離子濃度下，對電泳液pH值的緩衝能力佳，但因為在固定電壓下會使電流傳導增強，致產生過熱的情況，甚至其熱度可使膠體融熔；在低鹽離子濃度下，則電流傳導不易，致核酸不易移動。電泳緩衝液依其所含鹽類不同，可分為三類（如表三）：Tris-acetate （TAE）、Tris-borate（TBE）和Tris-phospdate（TPE）。TAE含40~50 mM Tris-acetate，當電泳時，acetate會被氧化成碳酸鹽，造成陽極pH值上升，陰極pH值下降，使得緩衝能力逐漸消失，所以長時間以TAE電泳，必須更換緩衝液。TBE含89~90 mM Tris-borate，是目前常用的緩衝液，其緩衝能力良好，可經長時間電泳。Agarose膠體電泳通常使用0.5× TBE；polyacrylamide膠體電泳則使用1× TPE。TPE含50 mM Tris-phosphate，經長時間電泳，緩衝能力會降低，必須更換緩衝液，且其不適於利用酒精沉澱自膠