实验七酵母核糖核酸的分离及组分鉴定.pptVIP

酵母核糖核酸的分离及组份鉴定 实 验 七 一 实 验 目 的 二 实 验 原 理 二 实 验 原 理 组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱 和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇 后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和 蛋白质。 浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速 冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。 稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去 蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA。 二 实 验 原 理 酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅 为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原 料。 酵母中的核糖核酸可溶于碱，在碱提取液中 加酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由 此得到粗核糖核酸。核糖核酸含有核糖，嘌呤 碱，嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水 解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 二 实 验 原 理 鉴定方法： (1)磷酸与定磷试剂作用能产生蓝色的钼蓝沉淀。 (2)核糖与地衣酚试剂反应呈鲜绿色。 (3)嘌呤碱与硝酸银产生白色的嘌呤银化合物沉淀。 嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键易于水解 三 仪器、原料和试剂 仪器：试管；试管架；烧杯；移液管； 量筒；滴管；水浴锅； 离心机；离心管；锥形瓶。 原料：干酵母粉 试剂： （1）0.04mol／L氢氧化钠溶液； （2）酸性乙醇溶液； （3）1.5mol／L硫酸； （4）0.1mol/L硝酸银溶液； （5）1mol/L浓氨水； （6）三氯化铁-浓盐酸溶液； （7）苔黑酚乙醇溶液 ； （8）抗坏血酸 ； （9）钼酸铵试剂。 四 操 作 步 骤 （一）酵母RNA的提取 （1）将2g酵母悬浮于10ml 0.04 mol／L氢氧化钠溶液中； （2）在沸水浴上加热30分钟后，将匀浆液转移至10ml离心 管中，冷却。配平离心(3000r／min)15分钟； （3）将上清液缓缓倾人盛有4ml酸性乙醇溶液的另一10ml离 心管中。注意要缓缓倾入，且用胶头吸管吹匀； （4）离心(3000r／min)3分钟，弃去上清液； 四 操 作 步 骤 （二）RNA成分的鉴定 在沉淀中，加入1.5 mol／L硫酸溶液3ml，在沸水浴中加热至少10分钟制成水解液并进行组分的鉴定。 （1）戊糖： 取1支试管加入水解液5滴、三氯化铁浓盐酸溶液10滴和苔黑酚乙醇溶液2滴。用木夹夹好后放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。 （2）嘌呤碱：?在1支干净试管内加入水解液5滴，再逐滴加入15滴氨水，然后加入约5滴硝酸银溶液，放置片刻，观察有无白色嘌呤碱的银化合物沉淀。 （3）磷酸： 取1支试管，加入水解液10滴和定磷试剂10滴。在水浴中加热，观察溶液颜色变化，溶液变蓝色，说明磷酸的存在。 五 思 考 题 1、如何得到高产量RNA的粗制品？ 2、本实验RNA组分是什么？怎样验证的？ 生物化学实验 * 1.了解并掌握稀碱法提取RNA的基本 原理及方法。 2.了解RNA的化学组成及定性鉴定的 原理与操作过程。 实验室： 工业生产： 核酸提取方法 （有活性的） （无活性的） 苯酚法 去污剂法 盐酸胍法 稀碱法---本实验 浓盐法 生物化学实验