实验三细胞外周血DNA的提取.pptVIP

实验三、外周血细胞基因组DNA的提取 (NaI法) 氯仿/异戊醇：使蛋白变性。 氯仿的作用是蛋白变性剂、抽提脂溶性物质; 异戊醇作用是A.降低表面张力、阻止气泡的产生(剧烈震荡时容易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用);B.有助于分相(使离心后水相、有机相稳定) 异丙醇：沉淀DNA 70%乙醇：洗涤DNA; (盐、蛋白等溶于70%乙醇，而DNA不溶) 100%乙醇：可以用于沉淀DNA，也可以用于使DNA快速干燥 限制性核酸内切酶作用原理 限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并对其进行切割的核酸内切酶。 PCR反应原理 基于DNA的半保留复制，两条链都可以作为模板。在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增DNA的目的。 PCR反应反复进行三步骤的循环过程： 热变性——退火——引物延伸 1）热变性：基因组DNA在95 ℃下加热5分，双螺旋结构被热变性解链为两股单链。 2）退火：将反应混合物降温至55~65℃，引物与上述单链DNA上互补的序列杂交在一起，即退火，形成模板——引物复合。 3）引物延伸：将反应混合物调节至72℃，在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，从引物3’端开始，沿着5’—3’的方向，按照模板链的序列，合成一条新DNA链，其序列与模板序列互补。 器具和试剂 离心机、振荡器、Eppendorf管，移液器等 抗凝人外周血，双蒸水，6M NaI溶液，氯仿/异戊醇，70％乙醇，TE溶液 试剂 抗凝人外周血，双蒸水，6M NaI溶液，氯仿/异戊醇，70％乙醇，TE溶液 步骤 1．取外周抗凝血（全血）200ul 于Eppendorf管中，12000rpm离心12min。 2. 弃上清，加双蒸水200ul 溶解，摇匀20s。混匀后加6M NaI溶液200ul，充分摇匀20s。 3. 加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。 步骤 4. 取上层液350 ul，加入另一新Eppendorf管中，加210 ul异丙醇，重新摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴Eppendorf管壁。 5. 弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动，可轻轻颠倒混匀），以15000rpm离心12min。 步骤 6. 弃乙醇，敞开Eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA。（制成的DNA液置于-20℃冰箱保存备用） 7．用DNA／RNA Calculator检测DNA的含量和纯度。纯DNA的此比值约为1.8～2.0。纯RNA的比值约为大于2.0。 步骤 8、限制性内切酶酶切： 下述各试剂加入Eppendorf管内： a、涡旋混匀，短暂离心。 b、置恒温水浴箱内，按EcoR I限制酶的活性温度要求，37℃酶解过夜 C、置于4℃或-20℃保存。 步骤 9、聚合酶链式反应： a、25 ul标准PCR反应体系各成分终浓度如下： b、标准PCR反应循环参数： 95℃：5 min预变性；94℃ 30s 63℃ 30s、 72℃ 60s， 共30个循环； 72℃ 7min。 c、置于4℃或-20℃保存。 * 基因组DNA提取原理 Loparev等报道利用NaI提取DNA的方法，从全血制备白细胞DNA，可用双蒸水溶涨红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核。加NaI破核膜并使DNA从核蛋白中解离，用氯仿/异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全（异戊醇去泡沫），DNA存在于上层水相中，以异丙醇沉淀 DNA，离心弃去异丙醇，并重复操作一次，即可获得白细胞DNA。 加双蒸水至 20ul (建议先算好体积，最先加) 1 ul EcoR I （10u/uL） 2 ul 10×酶解缓冲液 0.1-1 ug 人类基因组DNA 加双蒸水至 25ul (建议先算好体积，最先加) 2.5 uL 10×DNA聚合酶缓冲液 1 uL 下游引物 (10 uM) 1 uL 上游引物 (10 uM) 0.5～1 uL Taq DNA聚合酶 50～100 ng 模板DNA *