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浅谈甘油的原理与创新 　　宁摘要:以带小棒链霉菌XC-1-35为出发菌株，经紫外线照射60s，并结合甘油耐受性菌株的理性筛选，选育得到较佳诱变株XC-5-48，效价达1970μg/ml。该菌株经斜面连续传代4次，效价稳定在1800μg/ml以上。对该菌株的生理特性研究表明，其具有活力较强的甘油特异诱导的甘油转运系统(GTS)。以XC-5-48菌株为试验菌株，当培养基中甘油初始浓度为1.5%，并且在发酵60h时补加1.0%的甘油，摇瓶发酵的效价可达2668μg/ml，较出发菌株(318μg/ml)提高了7.4倍。该工艺应用于15L发酵罐共十个批次的发酵试验，96h时克拉维酸的平均效价达2103μg/ml。 　　关键词：甘油；原理；创新 　　Abstract: in Streptomyces clavuligerus XC-1-35 as starting strain, after UV irradiation of 60s, and combining with the screening of glycerol tolerance strains breeding is rational, mutant XC-5-48, the titer of 1970 μ g/ml. The strain was inclined 4 passages, was stable at more than 1800 μ g/ml. Study shows that physiological characteristics of this strain, which has strong glycerol glycerol transport system activity induced (GTS). Strain XC-5-48 was selected as the test strain, when the initial concentration of glycerol medium for 1.5%, and adding 1% glycerol in fermentation 60H, fermentation in shake flask titer reached 2668 μ g/ml, compared with the starting strain (318 μ g/ml) increased 7.4 times. Fermentation is the process used in 15L fermentation tank, a total of ten batches, the average titer 96h clavulanic acid reached 2103 μ 　　Keywords: glycerol; principle; innovation 　　1 材料与方法 　　(1)菌种 　　带小棒链霉菌(Streptomyces clavuli-gerus)XC-1-35，系浙江医药股份有限公司新昌制药厂保藏菌株。 　　(2)培养基及培养条件 　　斜面及平板培养采用高氏1号培养基，28℃培养8～9d。 　　种子培养250ml三角瓶装30ml培养基，置旋转式摇床28℃，220r/min振荡培养48h。培养基成分(g/L)：可溶性淀粉15，甘油15，鱼粉20，CaCO3 3，pH6.5～7.0。 　　摇瓶发酵250ml三角瓶装30ml培养基，接种量10%，28℃，220r/min振荡培养96h。培养基成分(g/L)：淀粉50，甘油5，黄豆粉30，玉米浆5，CaCl2 0.1，NaCl 0.1，FeSO4·7H2O 0.1，MgCl2·6H2O 0.1，KH2PO4 0.8，CaCO3 3，pH6.5～7.0。 　　(3)分析方法 　　克拉维酸含量测定发酵液采用6mol/L盐酸调pH至3.5～4.0，3500r/min离心10min，去除菌丝体和固体残渣，吸取5ml上清液，12000r/min离心10min后，用重蒸水适当稀释，供HPLC检测。色谱条件为：色谱柱C18，ODS(4.6mm×150mm)，柱温25℃。检测器：VWD(SPD-10A)，检测波长220nm，流动相：0.02mol KH2PO4∶乙腈(400∶12，体积比)，流速0.7ml/min，进样量10μl。 　　菌丝浓度测定取10ml发酵液，4000r/min离心15min，测得沉淀物在发酵液中所占的比例即为菌丝浓度。pH测定pH电极测定。 　　(4)菌种诱变处理 　　单孢子悬液的制备将冷冻孢子移种子斜面，培养成熟后加入500μg/ml的无菌咖啡因溶液(作助变剂)，刮下孢子并打散，用无菌滤纸过滤即得。