06 纸层析法分离氨基酸.pptVIP

纸层析法分离氨基酸 实验目的 1、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术 (包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。 2、学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。 实验原理 1、纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。 2、溶质在滤纸上的移动速度用比移值Rf值表示： 3、Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 4、在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 实验材料与试剂 实验试剂 1、氨基酸标准液(1mg/mL) 亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。 2、80%甲酸 3、0.1%茚三酮丙酮溶液 4、氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL) 5、正丁醇 实验器材 1、新华滤纸 2、培养皿 3、电热鼓风干燥箱 4、吹风机 5、毛细管 6、针、线、尺。 7、钟罩(高约430mm,直径约290mm，具磨口塞) 实验操作 标准氨基酸纸上层析 单向上行层析 A、滤纸：选用国产新华 1号滤纸， 6cm×7cm。在距滤纸2cm处划线，用铅笔在线上标上四个点作为点样位子（留出缝线空间）。 B、点样：点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清。用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用吹风机吹干，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，影响定量结果。 将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。 C、展层：将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内 (注意滤纸不要碰皿壁)，当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置 酸溶剂系统：正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，茚三酮2ml。温度25℃，时间1h。 注意：使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。 D、显色：待展层基本结束后, 置65℃鼓风箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。 E、Rf值的计算：用尺测量显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，即得氨基酸的Rf值。 计算出 3种氨基酸在酸系统中的Rf值，判断待测样组成。 注意 使用茚三酮显色法，必须在整个层析操作中避免手直接接触层析纸，因为手上常常有少量含氮物质。显色时它也呈现紫色斑点。污染了层析结果，因此操作时应戴橡皮手套或指套。同时也要防止空气中的氨。 思考题 1、为什么在展层时有时用一种溶剂系统，而有时用两种溶剂系统? 2、酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对氨基酸极性基团的解离有何影响? 3、酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对碱性氨基酸(赖、精、组)和酸性氨基酸(天冬、谷)的Rf值有什么影响? 4、什么是分配系数？ * * 判断待测氨基酸 Rf 原点到溶剂前沿的距离 原点到层析斑点中心的距离 待测氨基酸 脯氨酸 甘氨酸 亮氨酸 *