AGP柱的使用说明.docVIP

CHIRAL-AGP 100.4操作说明 安装 AGP100.4出货溶剂为15%异丙醇蒸馏水溶液。首先用蒸馏水冲洗，开始流速较低，然后慢慢增加到0.5ml/min，并维持2mins，随后流速增加到0.8-0.9ml/min时保持10min，使用流动相平衡色谱柱，推荐流速为0.8-0.9ml/min。 为了保护分析柱不被高亲和力和颗粒杂质污染，推荐使用保护柱，且必须定期更换保护柱，否则将影响分析柱的性能，用于生物分析时尤为重要。 保存 色谱柱室温保存。使用时，可以在色谱系统中过夜。但是当缓冲盐中没有有机改性剂，或者有机溶液中含有低浓度乙腈时，必须非常小心，因为在这样的流动相中微生物生长迅速。所以流动相必须现场配制。周末或者短期保存，可将色谱柱置于10%异丙醇的蒸馏水中。长时间的保存，请保存在15%的异丙醇蒸馏水中，使用前，请重复操作上面的安装步骤。 流动相组成 缓冲液 使用不同种类的缓冲液能得到最好的分离效果，比如：磷酸钠或磷酸钾缓冲液，乙酸铵或乙酸钠缓冲液，甲酸甲酯或柠檬酸缓冲液。推荐浓度范围0.01-0.1M，正常：10-20mM。 pH 色谱柱pH范围：4-7，pH值长时间的大于7或者小于4，都可能缩短色谱柱寿命，导致二氧化硅分解。 有机改性剂 推荐使用下列有机改性剂：1-丙醇，异丙醇，甲醇，乙醇和乙腈，丙醇和异丙醇及乙腈是使用最频繁的有机改性剂。无电荷改进剂的类别和浓度对分离因子的影响很大。如：1-丙醇，异丙醇和乙腈在异构体选择性方面有很大的不同，见方法开发部分。使用阳离子和阴离子改性剂也能调整保留时间和异构体选择性。但是，由于对基体的高亲和力，有些改性剂很难全部洗脱，这样，可能影响色谱柱的性能。我们推荐使用无电荷的、阴离子的、阳离子的改性剂。 室温范围20-25℃，但是色谱柱也能在高于或低于该温度下使用，然而当色谱柱使用温度过高时，对所有硅胶基色谱柱，都将缩短色谱柱寿命。 样品 当进样针体积为10-20μL时，推荐的样品浓度低于0.10mg/ml，如果可能，将样品溶解在流动相中，如果样品在流动相溶解性不好，加一些高浓度的有机溶剂改性剂，但是有机改性剂的浓度太高，小心引起缓冲盐析出沉淀。避免将样品溶在有机溶剂中。不要注射不干净的样品或者样品中包含有未溶解化合物。在生物分析过程中，使用分离技术过滤样品溶液，定期更换保护柱。 清洗色谱柱 如果色谱柱被疏水性原料污染了，将色谱柱反过来（不接检测器），用25%的异丙醇蒸馏水溶液冲洗一个晚上，流速0.2ml/min。 方法开发（UV检测器） 样品特征和最初的流动相 化合物类型 最初流动相 疏水性化合物 10mM醋酸铵或醋酸钠缓冲液，pH4.5 亲水胺，弱酸（苯酚等），非质子类（胺，酯，醇等） 5%的异丙醇10mM磷酸钠缓冲液，pH7.0 强酸（羧酸） 10mM磷酸钠缓冲液，pH7.0 如果化合物包含一些官能团，按照质子官能团确定使用下列哪种方法 疏水性胺：根据最初流动相得到的结果，请按下列流程 保留时间和异构体选择性 没有或低异构体选择性，低保留时间 异构体选择性和保留时间都高 高保留时间，无异构体选择性 pH值或无电荷改进剂的优化。 逐渐增加pH值，用异丙醇调整保留时间， ↓ 检测另一中无质子改进剂：乙腈，甲醇，丙醇，乙醇 ↓ 测试低浓度质子改进剂：辛酸1-20mM；己酸或庚酸1-20mM；四乙基胺或四丙基胺1-5mM。 pH降低至4，或增加异丙醇。 ↓ 测试另一中无质子改进剂：乙腈，甲醇，丙醇，乙醇 测试不同的无质子改进剂：异丙醇，乙腈，甲醇，丙醇，乙醇。 ↓ 测试低浓度质子改进剂：辛酸1-20mM； 己酸或庚酸1-20mM；四乙基胺或四丙基胺1-5mM。 亲水性胺，弱酸，非质子化合物：根据最初流动相得到的结果，请按下列流程 保留时间和异构体选择性 没有或低异构体选择性，低保留时间 异构体选择性和保留时间都高 高保留时间，无异构体选择性 pH值或无电荷改进剂或缓冲盐的优化。 降低异丙醇的浓度。 ↓ 测试另一中无质子改进剂：乙腈，甲醇，丙醇，乙醇 ↓ 胺：检测低浓度质子改进剂：辛酸1-20mM；己酸或庚酸1-20mM；四乙基胺或四丙基胺1-5mM。 pH值逐渐减低，增加异丙醇的浓度。 ↓ 测试另一中无质子改进剂：乙腈，甲醇，丙醇，乙醇 见疏水性胺的操作流程 强酸（如羧酸）：根据最初流动相得到的结果，请按下列流程 保留时间和异构体选择性 没有或低异构体选择性，低保留时间 异构体选择性和保留时间都高 高保留时间，无异构体选择性 pH值或无电荷改进剂或缓冲盐的优化。 降低pH值，增加缓冲盐浓度到50-75mM（最高浓度100mM）